毡毛马兰酚性成分及其抗肿瘤活性

黄宇飞 张 楠 周忠玉杨家欣刘劲松王国凯*

（1.安徽中医药大学药学院，中药与开发安徽省重点实验室，安徽合肥 230012；2.安徽省中医药科学院药物化学研究所，安徽合肥 230012；3.中国科学院华南植物园，中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室，广东广州 510650；4.台湾中国医药大学附设医院医学研究部，台湾台中40447）

毡毛马兰Kalimeris shimadae（Kitam.）Kitam.为菊科马兰属的一种多年生草本植物,有根状茎,别名岛田马兰、毡毛鸡儿肠等。产于安徽、浙江、福建、台湾、江苏南部、江西南部、湖北及湖南北部等,生于林缘、草坡或溪岸等。可用于清热解毒、利尿、凉血、止血,也用于目赤［1］。本课题组近十多年一直从事马兰属相关研究,分离并鉴定了三萜、黄酮、酚酸类等多种成分［2-8］。本实验对毡毛马兰进行化学成分研究,从中分离鉴定了12个酚性化合物,且所有化合物均为首次从该植物中分离得到。化合物6、8对8种肿瘤细胞有一定的细胞毒活性。

1 材料

Waters AutoSpec Premier P776质谱仪（美国Waters公司）；Bruker AV-400和DRX-500核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Agilent 1100型和1260型HPLC （美国Agilent公司）；柱层析硅胶（200～300目）、GF254硅胶板（青岛海洋化工厂）；RP-18反相填料（40～75 μm,日本富士公司）；Sephadex LH-20为（瑞典GE公司）；色谱纯试剂（德国默克公司）；其他试剂均为分析纯。

毡毛马兰药材于2016年7月采集于安徽合肥市少荃湖,经安徽中医药大学杨青山老师鉴定为菊科马兰属毡毛马兰Kalimeris shimadae（Kitam.）Kitam.干燥全草。凭证标本（201601）保存于安徽中医药大学药学院天然药物化学研究室。

2 提取与分离

干燥药材20 kg,80%乙醇回流提取3次,每次2 h,合并提取液,减压浓缩得到3.2 kg流浸膏。经硅胶柱二氯甲烷-甲醇（100 ∶0～0 ∶100）梯度洗脱,得11个组分（L1-L11）。

组分L5经硅胶柱石油醚-丙酮 （100 ∶ 0、50 ∶1、10 ∶1、1 ∶1）梯度洗脱,得5个亚组分L5.1～L5.5,组分L5.4经硅胶柱二氯甲烷-甲醇（100 ∶0、50 ∶1、30 ∶1、10 ∶1、1 ∶1）梯度洗脱,得4个亚组分L5.4.1～L5.4.4,组分L5.4.2经反相Rp-18柱甲醇-水（25 ∶75～100 ∶0）梯度洗脱,得10个亚组分L5.4.2.1～L5.4.2.10,组分L5.4.2.2经凝胶柱氯仿-甲醇 （1 ∶ 1）和制备HPLC乙腈-水（5 ∶95～25 ∶75）纯化得化合物1（5.2 mg）；组分L5.4.2.3经凝胶柱（甲醇）色谱和制备HPLC乙腈-水（8 ∶92～8 ∶92）纯化得化合物2 （8.4 mg）；组分L5.4.3.1.3析出无色针状结晶,经反复重结晶并经凝胶柱（丙酮）色谱纯化得化合物5 （3.5 mg）。组分L5.4.3.1.7析出黄色针状结晶,经反复重结晶得化合物12 （33.5 mg）。组分L5.4.3.2经凝胶柱（甲醇）色谱分离得4个亚 组 分 L5.4.3.2.1～ L5.4.3.2.4,组 分L5.4.3.2.2经制备HPLC乙腈-水（12 ∶88～12 ∶88）纯化得化合物9 （8.5 mg）；组分L5.4.3.2.3经制备HPLC乙腈-水（12 ∶88～32 ∶68）纯化得化合物8 （2.5 mg）；组分L5.4.3.2.4经硅胶柱石油醚-丙酮（15 ∶1～1 ∶1）梯度洗脱分离得化合物6 （3.4 mg）、7 （15.5 mg）。组分L5.4.3.3析出无色针状结晶,经反复重结晶和制备HPLC乙腈-水（15 ∶85～30 ∶70）纯化得化合物3 （16.5 mg）；组分L5.4.3.3母液经硅胶柱色谱石油醚-丙酮（5 ∶1）洗脱,经凝胶柱（丙酮）色谱纯化得化合物4（1.8 mg）。组分L6经反相Rp-18中压柱色谱甲醇-水（20 ∶80～100 ∶0）梯度洗脱分离得26个亚组分L6.1～L6.26。组分L6.4硅胶柱色谱石油醚-丙酮（10 ∶1～8 ∶1）梯度洗脱得4个亚组分L6.4.1～L6.4.4,组分L6.4.2经制备HPLC乙腈-水（10 ∶90～30 ∶70）纯化得化合物10 （4.9 mg）；组分L6.4.4经制备HPLC乙腈-水（5 ∶95～20 ∶80）纯化得化合物11 （6.6 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：紫色粉末,易溶于甲醇,ESI-MS m/z：151.2 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CD3OD）δ：9.71 （1H,s,-CHO）,7.41 （1H,brd,H-6）,7.40 （1H,brs,H-2）,6.92 （1H,d,J=8.5 Hz,H-5）,4.95 （1H,brs,-OH）,3.89 （3H,s,-OCH3）；13C-NMR （100 MHz,CD3OD） δ：129.1 （C-1）,115.0 （C-2）,153.5 （C-3）,148.3 （C-4）,109.9（C-5）,126.6 （C-6）,191.5 （-CHO）,55.0 （-OCH3）。以上数据与文献［9］基本一致,故鉴定为香草醛。

化合物2：淡紫色针状结晶,易溶于氯仿,ESI-MS m/z：181.1 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CDCl3） δ：9.81 （1H,s,-CHO）,7.14 （2H,s,H-2,6）,6.13 （1H,s,-OH）,3.96 （6H,s,3,5-OCH3）；13C-NMR （125 MHz,CDCl3） δ：128.4 （C-1）,106.7 （C-2,C-6）,147.4 （C-3,C-5）,140.8（C-4）,190.8 （-CHO）,56.5 （3,5-OCH3）。以上数据与文献［10］基本一致,故鉴定为丁香醛。

化合物3：无色针状结晶,易溶于甲醇,ESIMS m/z：193.0 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.58 （1H,d,J=16.2 Hz,β-H）,7.12（1H,H-2）,7.03 （1H,H-6）,6.81 （1H,d,J=8.0 Hz,H-5）,6.30 （1H,d,J=15.7 Hz,α-H）,3.86 （3H,s,3-OCH3）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：127.8 （C-1）,116.0 （C-2）,149.3 （C-3）,150.3 （C-4）,116.5 （C-5）,124.0 （C-6）,147.0 （C-α）,111.7 （C-β）,171.3 （-C=O）,56.5（-OCH3）。以上数据与文献［11］基本一致,故鉴定为阿魏酸。

化合物4：淡黄色油状物,易溶于甲醇,ESIMS m/z：319.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.61 （1H,dd,J=8.4,1.9 Hz,H-4″）,7.56 （1H,H-6″）,6.89 （1H,d,J=1.5 Hz,H-2′）,6.80 （1H,d,J=8.2 Hz,H-3″）,6.76 （1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′）,6.72 （1H,d,J=8.2 Hz,H-5′）,4.75 （1H,dd,J=8.7,5.2 Hz,H-2）,4.25 （1H,dd,J=10.6,8.9 Hz,H-1b）,3.86（3H,s,5″-OCH3）,3.82 （3H,s,3′-OCH3）,3.71（1H,dd,J=10.6,5.1 Hz,H-1a）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：65.5 （C-1）,129.8 （C-1′）,130.4 （C-1″）,56.3 （C-2）,112.7 （C-2′）,153.1（C-2″）,199.6 （C-3）,149.3 （C-3′）,115.7 （C-3″）,147.0 （C-4′）,125.2 （C-4″）,116.4 （C-5′）,148.9 （C-5″）,122.2 （C-6′）,112.5 （C-6″）,56.4（3′-OCH3）,56.3 （5″-OCH3）。以上数据与文献［12］基本一致,故鉴定为2-（4-羟基-3-甲氧基）-3-（2-羟基-5-甲氧基）-3-氧-1-丙醇。

化合物5：无色针状结晶,易溶于氯仿,ESIMS m/z：445.2 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CDCl3） δ：7.71 （2H,d,J=7.0 Hz,H-2′）,7.53（1H,t,J=7.2 Hz,H-4′）,7.44 （2H,t,J=7.4 Hz,H-3′）,7.26 （5H,m,H-2‴～6‴）,7.15 （2H,m,H-3″,4″）,6.76 （1H,d,J=7.6 Hz,H-β）,5.99 （1H,d,J=8.7 Hz,H-α）,4.77 （1H,m,H-3）,4.34 （1H,m,H-1）,3.93 （1H,dd,J=11.3,4.6 Hz,H-2a）,3.82 （1H,dd,J=11.3,4.0 Hz,H-2b）,3.24 （1H,dd,J=13.9,6.0 Hz,H-8a）,3.06 （1H,dd,J=13.5,8.3 Hz,H-8b）,2.75（2H,m,H-9）,2.02 （3H,s,H-7）；13C-NMR（125 MHz,CDCl3） δ：49.4 （C-1）,64.6 （C-2）,55.0 （C-3）,170.2 （C-4）,167.1 （C-5）,170.8（C-6）,20.8 （C-7）,38.4 （C-8）,37.4 （C-9）,133.6 （C-1′）,127.1 （C-2′）,128.7 （C-3′）,131.9（C-4′）,136.6 （C-1″）,129.1 （C-2″）,128.6 （C-3″）,126.8 （C-4″）,136.6 （C-1‴）,129.3 （C-2‴）,128.8 （C-3‴）,127.2 （H-4‴）。以上数据与文献［13］基本一致,故鉴定为金色酰胺醇乙酸酯。

化合物6：淡黄色针状结晶,易溶于甲醇,ESI-MS m/z：137.0 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.77 （2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6）,6.91 （2H,d,J=8.6 Hz,H-3,5）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：122.9 （C-1）,131.7 （C-2,6）,115.2.（C-3,5）,163.7 （C-4）,169.1 （-COOH）。以上数据与文献［14］基本一致,故鉴定为对羟基苯甲酸。

化合物7：白色粉末,易溶于甲醇,ESI-MS m/z：199.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.32 （2H,s,H-2,6）,3.88 （6H,s,3,5-OCH3）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：120.5 （C-1）,106.9 （C-2,6）,147.4 （C-3,5）,140.3 （C-4）,168.6 （-COOH）,55.4 （3,5-OCH3）。以上数据与文献［15］基本一致,故鉴定为丁香酸。

化合物8：白色粉末,易溶于甲醇,ESI-MS m/z：123.0 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：9.76 （1H,s,-CHO）,7.77 （2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6）,6.91 （2H,d,J=8.7 Hz,H-3,5）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：130.1 （C-1）,132.6 （C-2,6）,116.4 （C-3,5）,161.8 （C-4）,191.1 （-CHO）。以上数据与文献［16］基本一致,故鉴定为对羟基苯甲醛。

化合物9：白色针状结晶,易溶于甲醇,ESIMS m/z：227.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.31 （2H,s,H-3,5）,3.95 （2H,m,H-9）,3.90 （6H,s,2,6-OCH3）,3.18 （2H,m,H-8）；13C-NMR （100 MHz,CD3OD） δ：129.2 （C-1）,149.0 （C-2,6）,107.3 （C-3,5）,142.6 （C-4）,199.7 （C-7）,41.7 （C-8）,58.9 （C-9）,56.9（2,6-OCH3）。以上数据与文献［17］基本一致,故鉴定为3-羟基-1-（4-羟基-3,5-二甲氧苯基）-1-丙酮。

化合物10：淡黄色油状物,易溶于甲醇,ESIMS m/z：137.1 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.03 （2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6）,6.70 （2H,d,J=8.5 Hz,H-3,5）,3.68 （2H,t,J=7.1 Hz,H-8）,2.71 （2H,t,J=7.1 Hz,H-7）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：130.9 （C-1）,130.7 （C-2,6）,115.9 （C-3,5）,155.8 （C-4）,39.0 （C-7）,63.9 （C-8）。以上数据与文献［18］基本一致,故鉴定为对羟基苯乙醇。

化合物11：白色针状结晶,易溶于甲醇,ESIMS m/z：243.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.35 （2H,d,J=3.9 Hz,H-2′,6′）,5.14 （1H,d,J=3.8 Hz,H-2）,3.75 （1H,m,H-3b）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：199.6 （C-1）,75.5 （C-2）,66.3 （C-3）,107.7 （C-2′,6′）,149.2 （C-3′,5′）,56.9 （3′,5′-OCH3）。以上数据与文献［19］基本一致,故鉴定为2,3-二羟基-1-（4-羟基-3,5-二甲氧苯基）-1-丙酮。

化合物12：黄色针状结晶,微溶于甲醇、丙酮,ESI-MS m/z：347.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CDCl3） δ：12.76 （1H,s,5-OH）,7.88 （2H,d,J=8 .9 Hz,H-2′,6′）,7.03 （2H,d,J=8.7 Hz,H-3′,5′）,6.58 （1H,s,H-3）,4.03 （3H,s,6-OCH3）,4.01 （3H,s,8-OCH3）,3.89 （3H,s,4′-OCH3）；13C-NMR （125 MHz,CDCl3） δ：163.8（C-2）,103.7 （C-3）,183.0 （C-4）,162.7 （C-4′）,55.6 （4′-OCH3）,148.4 （C-5）,130.7 （C-6）,61.9（6-OCH3）,148.8 （C-7）,128.1 （C-8）,61.0 （8-OCH3）145.8 （C-9）,104.6 （C-10）,123.5 （C-1′）,127.4 （C-2′,6′）,114.6 （C-3′,5′）。以上数据与文献［20］一致,故鉴定为5,7-二羟基-4′,6,8-三甲氧基黄酮。

4 抗肿瘤活性

采用MTT法［7］测定化合物6、8分别对8种肿瘤细胞株,包括Cal27、SCC-4、SCC-9、HSC-3 4种口腔癌细胞株、A549、H460 2种肺癌细胞株以及HT29、Colo205 2种结肠癌细胞株（台湾中国医药大学附设医院提供）的细胞存活率。将化合物6、8分别制备成0、1、10、20 μmol/L的浓度作为加药组,同时采用紫杉醇 （0、0.1、0.5、1 μmol/L）作阳性对照药,同时设置空白对照组,先将癌细胞（10 000/孔）分别接种于96孔板,每孔100 μL,加入上述不同浓度化合物6、8,以及阳性对照药组,孵育20 h后,加入5 mg/mL每孔的MTT 10 μL,继续培养4 h后弃去上清液,每孔再加入100 μL DMSO溶解,490 nm测定吸光度。肿瘤细胞存活率是加药组与空白组比较,细胞存活率=（OD加药组）/ （OD空白组）×100%,抑制率=（1-存活率）×100%,IC50由抑制率通过Graphpad软件进行拟合计算所得。化合物6、8分别对8种肿瘤细胞株的IC50值见表1,结果表明化合物6、8对肿瘤细胞具有一定的抑制作用。

表1 各化合物抗肿瘤细胞IC50值（，μmol/L）Tab.1 IC50values of various compounds on cancer cells （，μmol/L）

表1 各化合物抗肿瘤细胞IC50值（，μmol/L）Tab.1 IC50values of various compounds on cancer cells （，μmol/L）

5 讨论

毡毛马兰为菊科马兰属草本植物,关于其研究报道较少。本课题组多年从事马兰属植物的相关研究,前期研究结果表明酚性成分是其重要的一类成分。本研究从中分离鉴定了12个酚性化合物,且所有化合物均为首次从该植物中分离得到,其中,阿魏酸具有降血脂、抗氧化、抗菌消炎、抗突变、防癌等作用［21］。丁香酸具有抗鼻咽癌CNE-1细胞株和CNE-2细胞株活性［22］。抗肿瘤活性实验结果显示化合物6、8对8种肿瘤细胞有抑制其生长活性的作用,以期为毡毛马兰药效物质基础的深入研究提供参考。