携HMME-Gd液态氟碳纳米粒造影剂的制备及体外双模态成像研究

罗远利 乔 斌 曹 进 袁 勋 谢卓晏 杨安宇 胡兴华 周志益 王志刚 任建丽

多模态分子成像是影像学发展的方向，是实现精准诊疗的必要手段。其可整合各种分子成像技术，弥补单一成像方式的局限性［1-3］。超声分子成像是分子影像学的重要分支，因其有成本低、安全性好、可对病灶组织进行实时、便捷显影等优点备受临床医师青睐。传统的微米级超声造影剂虽然可有效增强超声信号，但由于其直径远大于血管内皮间隙，仅能达到血池显像。而液气相变型造影剂可穿过血管内皮间隙，可能成为理想的超声造影剂［4］。由于超声成像受穿透深度影响较大，而MRI不受穿透深度限制，且对软组织有更好的成像效果，因此制备超声/MRI双模态成像造影剂具有重要临床意义。钆剂是目前临床最常用的MRI造影剂之一，钆离子（Cd3+）的4f层有7个未成对电子，具有很强的顺磁特性，可极大地增强肿瘤组织的T1弛豫率［5］。将Gd3+整合到血卟啉单甲醚可减轻其毒性，增加其包封率，因此血卟啉单甲醚-钆（HMME-Gd）有成为MRI造影剂的潜力［6-7］。研究［8］证明，在低强度聚焦超声（LIFU）的触发或温度升高的情况下，全氟戊烷（PFP）可由液态变为氟碳气态，增强超声成像信号。本实验拟采用高生物安全性的脂质体包裹HMME-Gd和PFP，构建一种超声/MRI双模态成像的纳米级造影剂即携带HMME-Gd的液态氟碳纳米粒（HMME-Gd-PFPNPs），并观察其体外超声/MRI双模态成像的效果，为肿瘤的精准治疗提供更多影像学依据，同时为新型超声造影剂的设计提供新思路。

材料与方法

一、主要实验材料

二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、胆固醇（CH）均由西安瑞禧生物科技有限公司生产；HMME-Gd（麦迪鑫生物科技有限公司）；PFP（Strem Chemicals公司）；琼脂糖（Life Technologies公司）；二甲基亚砜（DMSO）、三氯甲烷均由重庆川东化工（集团）有限公司生产。

二、主要实验仪器

倒置光学显微镜（Olympus IX71，日本Olympus公司）；粒径分析仪（Zeta-sizer 3000HS，英国Malvern有限公司）；透射电子显微镜（Hitachi H-7600，日本Hitachi公司）；紫外分光光度计（SHIMADZU UV-2550，苏州雨泽仪器有限公司）；声振仪（Sonics＆Materials，美国Sonic公司）；彩色多普勒超声诊断仪（MyLab 90，意大利百胜公司）；3.0 T磁共振成像仪（Verio-40690，西门子医疗系统有限公司）；LIFU超声仪（重庆医科大学超声影像学研究所）；旋转蒸发仪（RE-52A，上海亚荣生化仪器厂）。

三、主要实验方法

1.HMME-Gd-PFPNPs的制备：称取10 mg DPPC、4 mg DSPE、3 mg DPPG、3 mg CH、2 mg HMME-Gd，充分溶解于10 ml三氯甲烷中，50℃水浴条件下，用旋转蒸发仪工作1 h使溶液形成脂质薄膜，并用4 ml PBS洗下脂质薄膜。冰浴条件下，加入400 μl PFP，采用功率100 W的声振仪声振6 min。再用低温离心机洗涤3次（8000 r/min，5 min，4℃），最后用4 ml PBS重悬，获得HMME-Gd-PFPNPs。制备过程全程避光。

2.HMME-Gd-PFPNPs基本性质检测：采用倒置光学显微镜观察HMME-Gd-PFPNPs的大小及分散性；将125.00 μg/ml的HMME-Gd-PFPNPs滴于铜网上，风干成膜，采用透射电子显微镜观察HMME-Gd-PFPNPs的表面形态；采用粒径分析仪测量HMMEGd-PFPNPs的大小、分布及电位。

3.HMME-Gd包封率检测：取1 mg HMME-Gd溶于DMSO中，并用DMSO将溶液稀释成不同浓度（60.00 μg/ml、30.00 μg/ml、15.00 μg/ml、7.50 μg/ml、3.75 μg/ml）。采用紫外分光光度计检测各浓度溶液的紫外全波长，用吸光度（A411 nm）绘制标准曲线；经低温离心机洗涤后保留上清液，采用紫外分光光度计检测上清液在A411 nm的吸光度，根据标准曲线计算上清液中HMME-Gd的含量，计算包封率，包封率=［（HMME-Gd投入量-上清液中HMME-Gd含量）/HMME-Gd投入量］×100%。

4.体外超声成像：将250.00 μg/ml的HMME-Gd-PFPNPs通过不同功率［0 W/cm2（对照组）、0.8 W/cm2、1.6 W/cm2、2.4 W/cm2、3.2 W/cm2］LIFU辐照1 min后，置于琼脂糖凝胶模型中，使用彩色多普勒超声诊断仪观察B模式（B-mode）及造影模式（CEUS-mode）超声图像。并采用DFY组织灰度定量软件检测B-mode及CEUS-mode超声信号的灰度值。

5.体外MRI成像：采用PBS将HMME-Gd-PFPNPs稀释为不同浓度（31.25μg/ml、62.50μg/ml、125.00μg/ml、250.00 μg/ml、500.00 μg/ml），以PBS为对照组，分别置于2 ml EP管内，使用3.0 T磁共振成像仪采集T1加权图像。

四、统计学处理

应用GraphPad Prism 8.0.2统计软件，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较行独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、HMME-Gd-PFPNPs的基本性质

制备的HMME-Gd-PFPNPs于倒置光学显微镜下呈形态规则、大小均一（图1A）；于透射电子显微镜下呈黑色的球形结构（图1B）。粒径分析仪测得HMMEGd-PFPNPs平均粒径为（250.27±11.9）nm，平均电位为（-26.17±0.45）mV。见图1C、D。

二、HMME-Gd的包封率

HMME-Gd在波长为411 nm处出现最高峰（图2）；将波长设定在411 nm，选择吸光度为0.2～0.8的数值绘制标准曲线（图3），计算出HMME-Gd的包封率为（84.70±0.35）%。

三、体外超声成像

随着LIFU功率增加，B-mode及CEUS-mode的回声均逐渐增强，且各实验组回声均高于对照组，见图4；B-mode及CEUS-mode超声图像的灰度值也逐渐增加，与对照组比较差异均有统计学意义（均P<0.05），见图5。

四、体外MRI成像

随着HMME-Gd-PFPNPs浓度增加，T1加权图像信号逐渐增强。见图6。

讨 论

本实验在现有分子影像探针的基础上应用生物相容性较好的脂质体［9］作为壳膜材料，包裹PFP和HMME-Gd，利用薄膜水化法、乳化法制备了可进行超声/MRI双模态成像的纳米粒HMME-Gd-PFPNPs。脂质体［10］的生物安全性良好，制备成纳米粒之后，由于粒径较小，表面积增大，可显著增加细胞对其的摄取，同时保证纳米粒在体内不会对正常组织造成损害。血卟啉单甲醚（HMME）作为光敏剂，具有成分明确、结构简单、光敏化作用强、在生物体清除速度快等特点［11-12］。目前，卟啉已广泛应用于医疗行业各方面，金属离子的掺入使卟啉在医学影像学展现出了可观的发展前景［13］。Mouraviev等［14］成功研制了掺入锰离子的卟啉，发现其可有效增强前列腺肿瘤的MRI成像；Zheng等［15］发现锰卟啉可通过MRI信号的变化来检测温度的细微变化。但过量的锰离子可对人体中枢神经系统产生一定的副作用，这也是临床上不采用锰离子作为MRI造影剂的原因之一。因此，本实验选用亲和性较强的HMME螯合Gd3+，将其包载在脂质体的磷脂双分子层之间，凭借脂质类物质对肿瘤细胞的亲和力，使HMME-Gd在肿瘤区域大量积聚，并实现T1加权MRI成像，在肿瘤的影像学诊断方面有广泛的应用前景。而包载在HMME-Gd-PFPNPs内核的PFP在常温下为液态，可在LIFU辐照后转变为气态，促使纳米粒逐渐膨胀实现增强超声成像［16］，且脂质体碎片也无需生物降解。因此，将HMME-Gd和PFP包裹进脂质体内制备成的纳米探针生物安全性高，有望作为一种双模态造影剂应用于临床。

本实验对HMME-Gd-PFPNPs的物理性质进行检测，发现HMME-Gd-PFPNPs呈棕褐色，颜色均匀，未见游离相。HMME-Gd-PFPNPs在光镜下呈大小均一、形态规则及较好的分散性；电镜下呈250 nm左右的类圆形。粒径分析仪测定其平均粒径为（250.27±11.9）nm。体外超声成像显示，随LIFU功率的增加，B-mode及CEUS-mode超声图像的回声呈逐渐增强趋势，而对照组（0 W/cm2）未显影；定量分析显示，与对照组（0 W/cm2）比较，随着LIFU功率的增加，B-mode及CEUS-mode超声图像的灰度值也逐渐增加，且各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（均P<0.05），表明HMME-Gd-PFPNPs成功包载了PFP，且在LIFU辐照下，由于超声的机械效应和热效应使纳米粒内部包裹的PFP发生液-气相变，从而达到增强B-mode及CEUS-mode成像的效果。本实验后期还利用3.0 T磁共振成像仪评价HMME-Gd-PFPNPs体外MRI成像效果，发现随HMME-Gd-PFPNPs浓度增加T1加权图像信号逐渐增强，而对照组（PBS）未见明显显影，进一步证实了HMME-Gd被成功包裹进入HMME-Gd-PFPNPs。

综上所述，本实验通过薄膜水化法、乳化法成功制备了包载HMME-Gd和PFP的纳米粒HMME-Gd-PFPNPs，其形态较规则、大小较均一，在体外的超声/MRI双模态显影效果均比较明显，表明HMME-Gd-PFPNPs具有超声/MRI双模态成像的能力。本实验HMME-Gd-PFPNPs主要依赖被动靶向（增强渗透滞留效应）聚集于肿瘤部位，后期实验可连接特异性配体（如肿瘤归巢穿膜肽）或天然细胞膜结构提高纳米粒主动靶向的能力，为下一步体内外肿瘤的精准诊疗提供新方向。