联合肝脏离断和门静脉结扎的二步肝切除术后肝再生机制

曾陶飞， 陈光磊， 刘彩刚， 戴朝六， 徐 锋

中国医科大学附属盛京医院 普通外科， 沈阳 110004

肝切除手术是肝脏恶性肿瘤目前最主要且行之有效的治疗手段。剩余肝脏(future liver remnant，FLR)体积大小很大程度地影响了肝切除术后肝衰竭的发生率，是肝切除术前评估的重要指标[1]。标准化肝体积(standard liver volume，SLV)是基于体质量和体表面积计算得出。肝脏正常者FLR/SLV>25%～30%即可耐受较大范围的肝切除术，伴有肝硬化或肝实质损伤者FLR/SLV则需>40%[2]。过去20年中，门静脉栓塞术(portal vein embolization，PVE)和门静脉结扎术(portal vein ligation，PVL)逐渐发展成为增加FLR的主要方法，但是通常需要等待3～6周甚至更长时间才能使FLR体积满足手术要求。在此期间，患者常因肿瘤进展等原因而失去二次手术机会[3]。

联合肝脏离断和门静脉结扎的二步肝切除术(associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy，ALPPS)能使正常肝脏在1～2周提升FLR体积达47%～93%，是PVL的1.5～2倍[4]，为FLR体积不足的肝癌患者带来了希望。然而，我国是肝炎大国，80%以上肝癌患者伴有不同程度的肝硬化，肝硬化患者ALPPS术后FLR再生速度明显减缓，使其临床价值大打折扣[5]。目前，ALPPS术后肝再生机制尚未完全阐述清楚，探明其机制将有助于解决FLR不足及肝再生速度缓慢等临床问题。为此，学者们进行了不懈探索，并取得了一些成果。笔者现就此相关研究进展做一综述，希望能为后续研究提供参考。

1 ALPPS诱导肝脏快速再生的机制学说

1.1 血流动力学说 此学说认为，ALPPS主要通过改变门静脉血流量、门静脉压力梯度以及肝动脉的血流供应诱导肝脏快速再生。研究发现：ALPPS一期手术(门静脉结扎+肝脏离断)后门静脉总血流量没有发生明显改变[6-8]或略有下降[4]，但未结扎侧门静脉压力显著升高，门静脉发生扩张，FLR单位组织内血流量增加4～6倍，流向FLR的肝营养因子显著增加，促进肝脏快速再生[4，8-9]。然而，FLR的灌注压并非越高越有益，当肝-门静脉压力梯度<15 mm Hg或门静脉压力<20 mm Hg时，FLR的体积增加和功能恢复程度最高[10]。另外，门静脉侧支形成的数量与FLR的再生速度呈显著相关，侧支形成的数目越少，FLR再生速度越快[8]。ALPPS完全阻断了荷瘤肝脏与FLR之间门静脉侧支循环的形成。而在PVL和部分肝脏离断的ALPPS中，荷瘤肝脏与FLR之间存在着大量新的门静脉侧支。因此，离断荷瘤肝脏是ALPPS诱导FLR迅速增生肥大的关键所在，使得ALPPS术后FLR的再生速度与程度均显著大于PVL[8]。

ALPPS不仅改变门静脉血流供应，还显著影响肝动脉血流。研究[4,10]发现，ALPPS一期手术后FLR的肝动脉代偿性收缩，肝动脉血流量显著下降，导致FLR发生严重的缺氧反应。缺氧阻断了脯氨酸羟化酶对缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)1的降解，导致HIF-1α及HIF-2α的核质比显著升高并激活缺氧信号通路，促进FLR增殖；相反，对ALPPS术后的小鼠肝脏持续供氧，则FLR再生速率显著下降[6]。此外，FLR缺氧信号激活还有助于保持肝窦形态的完整性，重建有效的肝窦床，维持肝小叶结构，有利于维持肝细胞增殖功能[4]。因此，ALPPS引起的缺氧反应可能是维持再生肝脏功能及其迅速再生的一个必要条件[4]。

1.2 体液学说 该学说认为，体液因素在ALPPS诱导肝脏再生过程中发挥关键作用。Schlegel等[11]对比分析了ALPPS和PVL附加其他脏器损伤(肾脏、脾脏或肺部分消融术)后肝再生速度，发现四组间没有明显差别。而将ALPPS术后小鼠血浆注射到PVL小鼠体内，结果PVL小鼠与ALPPS小鼠的肝再生速度也无明显差异。这说明ALPPS促进FLR快速再生可能是手术创伤引起的炎症反应所致，并且这些生长因子不是肝脏所特异性产生的。进一步研究发现，ALPPS术后血浆和FLR中TNFα、IL-6、HIFα、转录活化因子(STAT)3、肝细胞生长因子(HGF)、编码细胞周期蛋白D1(CCND1)、中性粒细胞趋化因子-1、巨噬细胞炎性蛋白1α等细胞因子浓度均显著升高[9,11-13]；高迁移率族蛋白B1、晚期糖基化终产物受体和Toll样受体4等创伤相关因子的浓度也显著升高；IL-6/TNFα/STAT3通路相关的基因表达显著上调[11]；并且IL-6与HGF的表达呈正相关，FLR的体积增加与血浆HGF的浓度呈正相关，与IL-6、表皮生长因子、TNFα以及血管内皮生长因子 (vascular endothlial growth factor，VEGF)的浓度无关[12,14]；ALPPS术后Wnt2的表达与Ki-67的表达呈正相关性[15]。此外，荷瘤肝脏中HGF等促进肝细胞增殖的体液因子显著升高，而Ki67却没有明显增加，这说明荷瘤肝脏也可作为FLR的再生刺激物，通过体液途径刺激FLR的增殖肥大[12]。这些数据表明ALPPS手术诱导产生的细胞生长因子和创伤相关因子在肝脏再生中发挥着关键作用。

2 ALPPS对肝组织中细胞的影响

ALPPS术后FLR基因表达谱发生了改变，表现为细胞周期、离子转运、有丝分裂和细胞器分裂等相关基因表达上调，细胞黏附、免疫系统和细胞增殖相关基因显著富集[16-17]。肝实质细胞、非实质细胞以及浸润的炎性细胞包括肝星状细胞(HSC)、Kupffer细胞、巨噬细胞和骨髓源性细胞协同参与了肝脏再生过程[9]，免疫系统在肝再生调节中也发挥了关键作用。

2.1 ALPPS促进细胞增殖 ALPPS术后FLR体积在短期内迅速增长不是被动充血或水肿所致，而是细胞增殖的结果[18]。体现在，FLR中Ki67和pH3阳性肝细胞数量显著增加[4,6,8,11]。Ki67与pH3是公认的细胞增殖活跃的标志物，这充分说明ALPPS可促进肝细胞增殖。另外，绝大部分的细胞周期蛋白在术后早期显著上升。CCND1是肝细胞周期的关键启动子，ALPPS术后8 h达特异性峰值，细胞周期抑制蛋白p21则显著下调[19-20]。这也说明ALPPS可使肝细胞进入细胞周期的时间显著提前，最终使FLR在短时间内迅速再生肥大。

2.2 ALPPS影响肝实质细胞的线粒体功能 ALPPS一期术后FLR快速再生，对能量需求显著增加，但ALPPS严重损伤了肝细胞能量再生过程，从而导致肝细胞能量的产生与消耗发生严重失衡，FLR的功能恢复明显滞后[21]。肝衰竭是ALPPS术后患者死亡的主要原因，而线粒体功能障碍是术后肝衰竭的一个独立危险因素，这也可能是ALPPS术后肝衰竭发病率较高的重要原因之一[22]。

小鼠模型中，虽然ALPPS术后FLR耗氧量和ATP产生量暂时增加，但术后48 h，还原型辅酶Ⅰ(Ⅱ)水平明显降低，氧化磷酸化内源性底物供应受到严重损害，线粒体横断面积明显缩小，小线粒体所占比例明显增加，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)与核呼吸因子1 (Nuclear respiratory factors 1, NRF1)的表达水平低于PVL组，线粒体功能发生恶化[21,23]。ALPSS术后可产生大量的NF-κB p65、IL-6、TNFα等炎症因子，TNFα在启动FLR再生的同时[11,21]，也可通过NF-κB和p38 MAPK途径抑制NRF1和PGC-1α的表达[24-25]，使线粒体功能失调、生物合成受损，最终导致ALPPS术后肝细胞功能障碍[21]。在人体中，与肝部分切除患者相比较，尽管ALPPS术后线粒体功能发生恶化，但在ALPPS一期手术后至二期手术前，线粒体功能在不断地改善；ALPPS二期手术后肝再生相关基因(如STAT3、ALR)、能量代谢相关基因(如COX、Nampt)以及线粒体合成相关基因(如PGC-1α)表达均显著增加，COX1、PGC-1α、Nampt、SirT1等蛋白浓度在此期间也显著升高[23]。这说明FLR可能是通过SirT1/IL-6-PGC-1α-COX1轴发生能量代谢适应[23]。

2.3 非实质细胞的作用

2.3.1 肝星状细胞(HSC) HSC是肝组织最主要的非实质细胞，在肝脏急性损伤后的肝再生过程中发挥着重要作用。肝部分切除术后早期HSC分泌高浓度的HGF通过p38信号途径和细胞外信号调节激酶刺激肝干/祖细胞增殖。在肝脏再生的终末阶段，HSC则通过分泌大量的TGFβ1抑制肝干/祖细胞的DNA合成从而精确调控肝脏再生过程[26]。

在体外实验中，HSC激活缺氧信号通路后促进VEGF的产生及肝窦内皮细胞的体外增殖[27]。因此，ALPPS术后引起的缺氧环境可能是通过激活HSC的缺氧信号通路从而促进肝窦内皮细胞的增殖。最近的研究表明，HSC分泌的印度豪猪蛋白(Indian hedgehog，IHH)是ALPPS术后早期激活以及加速肝脏再生所必需的。通过分析ALPPS小鼠肝脏分化基因表达谱发现，丝裂原活化蛋白激酶8(Mapk8或JNK1)基因的mRNA表达高于对照组。ALPPS术后小鼠活化的HSC中可检测到较高水平的非磷酸化JNK1、磷酸化JNK(活性JNK)及IHH蛋白，这种共定位也与CCND1和IHH下游转录因子GLI1 相关。ALPPS诱导JNK1活化后产生IHH并通过JNK-IHH-GLI1-CCND1途径促进cyclin D1的基因表达。ALPPS小鼠使用JNK抑制剂后发现GLI1、cyclin D1和其他组织增殖标志物表达水平降低，肝脏再生显著减慢。有趣的是，使用JNK抑制剂的ALPPS小鼠恢复IHH信号通路后，肝脏再生反应回复到之前水平，GLI1和cyclin D1的表达水平也恢复，除此之外还增加了非磷酸化JNK和磷酸化JNK在细胞核中的表达水平，这说明IHH在ALPPS诱导肝脏再生JNK水平方面存在正反馈环，Hedgehog信号途径是ALPPS促进肝再生的关键介质[20,28]。

2.3.2 巨噬细胞 在肝脏固有免疫系统中，肝巨噬细胞(Kupffer细胞)是肝脏再生过程中研究最广泛的细胞。在肝脏中，巨噬细胞约占非实质细胞的20%，部分肝切除术后，巨噬细胞分泌TNFα和IL-6为肝脏再生提供原始动力，启动肝再生，是肝脏再生的有利因素[29-30]。倘若巨噬细胞减少或发生衰竭，缺乏巨噬细胞的小鼠不能产生类似的细胞因子反应，从而导致肝部分切除术后肝再生迟缓，巨噬细胞集落刺激因子缺乏亦不利于肝脏再生[31]。巨噬细胞在不同的炎症信号刺激下可以分为不同的极化类型。IFNγ和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可诱导巨噬细胞向M1型活化(经典活化途径)，分泌TNFα、IL-6等促炎因子发挥抗炎作用；而IL-4和IL-13诱导巨噬细胞向M2型活化(选择性活化途径)，分泌TGFβ、VEGF等因子发挥抗炎作用，促进创伤修复和纤维变性[31-32]。在经典的肝切除模型中，肝巨噬细胞通常向M2型分化，然而ALPPS一期术后，肝巨噬细胞数量显著增加且高表达COX-2，COX-2促使巨噬细胞由M2型向M1型转化。因此，巨噬细胞可能是ALPPS促进肝再生过程中的有利因素。

2.3.3 其他免疫细胞 目前免疫细胞及其亚群在ALPPS诱导肝脏再生过程中所扮演的角色尚不完全清楚。Anantha等[33]对比分析了ALPPS术后患者的FLR和荷瘤肝脏中免疫细胞的动态变化情况：ALPPS术后荷瘤肝脏中T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)数量有上升的趋势，FLR中NK细胞有增加趋势，但没有达到统计学意义，这可能与样本量不足有关。NK细胞也是肝脏固有免疫系统的重要组成部分，约占人类肝淋巴细胞的30%～50%[34]。与巨噬细胞相反，肝脏NK细胞不利于肝再生。部分肝切除术后肝脏NK细胞增多，激活的NK细胞分泌IFNγ，在肝细胞分泌的信号转导和STAT1、干扰素调节因子1和细胞周期调节基因(p21cipl/waf1)蛋白等抗增殖蛋白的介导下，抑制肝脏再生。而当NK细胞减少或发生衰竭时小鼠肝脏再生增强[35]。最新研究发现，NK细胞的共抑制受体TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory domains，带有Ig和ITIM的细胞免疫受体)也参与了肝脏再生，TIGIT与其配体PVR(poliovirus receptor,即CD155)结合后介导共抑制信号，抑制NK细胞活化。肝部分切除术后，肝脏NK细胞选择性上调TIGIT表达，最终通过TIGIT-PVR相互作用抑制NK细胞活化，最终促进肝脏再生[35]。目前有关ALPPS诱导术后肝脏再生过程中NK细胞的作用研究尚无相关研究报道，但鉴于ALPPS手术包括部分肝脏切除，因此NK细胞也有可能参与调节ALPPS术后肝脏再生过程。另外，ALPPS与PVL等不同术式引起的免疫细胞变化差异目前也尚不清楚，有待更进一步的研究。

2.3.4 其他非实质细胞 肝脏其他的非实质细胞包括肝窦内皮细胞、肝干/祖细胞等均参与肝脏再生过程。在人类肝脏中，大多数肝祖细胞产生于门静脉周围。肝祖细胞在正常肝脏中处于静止状态，只有在严重肝损伤时才开始增殖[36]。研究[37]发现，肝祖细胞参与ALPPS促进肝脏再生过程：1例转移性肝肿瘤患者行ALPPS一期手术前，在肝组织终末门区中仅可观察到少量的肝祖细胞；然而在二期手术前，每个区域的肝祖细胞数量增加了约3倍。国内学者还发现：ALPPS 术后产生IL-6、HGF等炎症因子可激活肝内祖/干细胞，从而促进肝脏快速再生[36]。

3 肝硬化条件下ALPPS术后肝再生

肝硬化条件下ALPPS术后FLR再生速度明显减缓。王征等[38]报道肝癌合并轻到中度乙型肝炎肝硬化患者ALPPS术后，FLR的增生速度较无肝硬化的肝脏组织明显减慢，平均12 d增长58%，但ALPPS诱导的FLR体积增加和FLR再生率比PVE大得多[5]。在肝硬化大鼠模型中也证实了这一观点，肝硬化大鼠ALPPS术后FLR再生速度明显低于正常大鼠术后，PCNA、cyclin D1、Ki67等表达水平均显著低于正常大鼠，Ki67峰值出现时间也晚于正常大鼠[39-40]，但ALPPS术后FLR再生速率显著快于PVL、PVE术后。这些数据说明肝硬化肝脏ALPPS术后较正常肝脏再生机制启动延迟，且FLR的肥大主要是由于肝细胞的体积增大所致而非再生[39，41]。目前，ALPPS促进肝癌合并肝硬化患者FLR再生机制的研究仍然较少，而我国是肝炎大国，原发性肝癌患者多数合并不同程度的肝硬化，进一步探索肝炎肝硬化背景下ALPPS促进肝再生研究有助于指导我国肝癌患者的临床实践。

4 小结

综上所述，ALPPS诱导肝脏再生过程是一个多细胞、多因子参与的调控过程。不仅仅是肝实质细胞，HSC、Kupffer细胞、NK细胞等非实质细胞在ALPPS术后肝脏再生过程中也发挥着重要作用。笔者认为，未来应更加关注“非实质细胞-肝实质细胞”之间的相互作用在ALPPS诱导肝脏再生中的作用，进一步明确ALPPS在肝硬化患者中的应用价值，制订符合我国国情的临床实践指南。

作者贡献声明：曾陶飞负责文献的检索与分析，撰写论文；陈光磊参与检索论文，修改论文；徐锋、戴朝六、刘彩刚教授负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后修改定稿。