DNA甲基化在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

向 岑综述，王海英，魏义勇审校

0 引 言

随着人口老龄化日渐加重，心血管疾病的发病率逐年增加。缺血性心肌病成为全世界人类死亡和致残的主要原因。当前，治疗心肌缺血的有效方法是尽早恢复心脏灌注，保护剩余存活心肌。近年来，血管成形术、体外循环下心内直视手术及溶栓术等得到普及，使缺血心肌得到了早期复灌，但是快速再灌注引起心肌细胞代谢障碍和结构破坏[1]，最终导致心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)。缺血、缺氧、炎症、自噬、氧化应激、线粒体功能障碍等均参与MIRI的病理过程[2]。长时间的心肌组织缺血使得ATP生成减少、细胞内pH降低，导致无氧代谢增强和乳酸蓄积。ATP酶依赖性离子转运功能受损，细胞离子调节机制被破坏，导致细胞内和线粒体钙超载，细胞肿胀、裂解，细胞凋亡、坏死和自噬，引起细胞死亡[3]。再灌注时，产生大量的活性氧(reactice oxygen species, ROS)，促炎性免疫细胞、炎症介质、细胞因子和趋化因子释放增加，引发炎症级联反应，加重缺血组织损伤。此外，MIRI还会引起缺血心肌表观遗传改变[4]。了解MIRI诱导的心肌表观遗传变化并研究具体机制将有助于研发新的治疗药物。

表观遗传学是指在DNA序列不改变的情况下，研究基因表达的可遗传变化。表观遗传修饰使细胞表型发生改变而基因型不变，从而调节基因表达。3种常见的表观遗传修饰类型是组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化以及DNA甲基化[5-6]。DNA甲基化是表观遗传学中研究的最广泛，最重要的表观遗传类型。DNA甲基化与许多疾病的发生发展有关，如癌症、神经系统疾病、心血管系统疾病等。识别与疾病相关的DNA甲基化标志物有益于我们了解表观遗传学在疾病病理生理学中的作用。本文就DNA甲基化在MIRI中的作用和研究前景作一综述。

1 DNA甲基化

1.1 DNA甲基化的概述及其生物功能DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMTs)催化下，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5-mC)的一种生化反应[7]。胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(cytosine-phosphate-guanosine-, CpG)是DNA甲基化发生的主要位点，哺乳动物的基因组序列约60%～90%的CpG均呈现甲基化状态[8]。在许多疾病中，DNA甲基化发生在CpG岛及其周围，并且这种甲基化的改变可调控基因表达。研究证实，靶基因启动子的高甲基化抑制基因表达，而低甲基化激活基因表达。5-mC在个体发育、细胞程序性增殖分化、衰老等生理过程中均能影响蛋白质和DNA的相互作用，从而调控基因表达[9]。

1.2 DNA甲基化与MIRI氧化应激和缺氧是缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)过程中常见的病理反应，两者均可能影响DNA甲基化。氧化应激可通过碱基修饰或缺失、染色体重排和其他表观遗传修饰改变DNA结构。DNA损伤可能影响DNMTs活性，从而改变DNA甲基化水平并调控基因转录[10]。十-十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase, TET)可以将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5-hmC)，5-hmC进一步氧化，实现低甲基化。该过程需要氧气供应，缺氧则抑制该反应[11-12]。因此，I/R时发生心肌组织缺氧可诱导TET活性降低，从而激活靶基因启动子片段高甲基化，抑制相关基因转录，干扰与机体应激反应、炎症反应、细胞自噬和凋亡等相关的信号转导通路。

2 DNA甲基化调控靶点与MIRI

2.1 磷酸酶和张力蛋白同源诱导的激酶1(phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase 1, Pink1)自噬是指将细胞内成分和细胞器传递至溶酶体进行降解的生理过程。细胞自噬参与调节体内多种代谢途径和信号转导通路，在维持细胞生长、发育、分化、衰老、凋亡，以及细胞内环境稳态等方面发挥重要作用[13]。细胞内自噬选择性作用于线粒体即为线粒体自噬。线粒体自噬通过选择性清除受损线粒体维持细胞能量代谢和线粒体功能。适度自噬可清除受损细胞器，挽救濒死细胞。过度激活自噬，却会引起细胞自噬性死亡[14]。Pink1是一种具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的线粒体外膜蛋白，可作为线粒体损伤的感受器和Pink/Parkin线粒体自噬通路的引发剂[15]，广泛表达于心肌、骨骼肌以及神经系统等高耗能组织。应激状态下，ROS引起线粒体损伤，导致Pink1蓄积在线粒体外膜，通过自身磷酸化与细胞内分子进行信号转导[16]。Pink1参与线粒体自噬相关的多个信号转导通路，在维护细胞结构、线粒体功能以及机体内环境稳态中发挥关键作用[17]。然而，近年来，越来越多证据表明Pink1因外界刺激不同或细胞内环境的改变对线粒体自噬产生不同影响。Zhou等[18]建立心肌细胞缺氧/复氧模型分析Pink1/FAM65B通路抑制自噬抗MIRI的作用机制，研究发现自噬相关circRNA(autophagy related circRNA, ACR)与DNMT3B结合，竞争抑制DNMT3B介导的Pink1启动子DNA甲基化，从而增加Pink1表达，激活Pink1/FAM65B通路，抑制过度自噬，从而减轻MIRI。因此，深入研究Pink1以及相关通路的DNA甲基化机制有利于发现治疗和预防MIRI的新靶点。

2.2 MicroRNA(miRNA)miRNA是一类内源性非编码小核糖核酸，包含21～24个核苷酸[19]。miRNA参与多个生物学过程，如自噬[20]、增殖、分化和凋亡[21]，通过靶基因与3′UTR的结合而负向调节基因表达[22]。miRNA对自噬的调控是由自噬相关基因如BECN1，LC3B和p62介导的[23]。有研究证实，心脏重塑和心力衰竭等病理生理过程会影响miRNA丰度[24-25]。如在大鼠心肌I/R模型的心脏组织中发现miRNA30a异常表达[26]。miRNA异常表达可能与表观遗传调控有关，如DNA甲基化和组蛋白修饰[27]。miRNA启动子DNA甲基化水平的改变可直接导致其表达水平改变[28]。Vera等[29]报道，miR-7甲基化水平升高可能是潜在的临床表观遗传靶点，可用于识别对铂衍生疗法反应不良的卵巢癌患者。Wang等[30]利用UCSC基因组学技术分析发现miR-30a全基因组存在2个CpG岛，其中miR-30a(-761/-216)片段是核心调控区，为甲基化提供了结构基础。同时用DNMTs抑制剂处理心肌细胞，发现DNMT3B抑制剂显著增强miR-30a的表达，而使用DNMT1和DNMT3A抑制剂未观察到明显作用。基因敲除DNMT3B可抑制miR-30a甲基化，同时心肌细胞miR-30a表达水平升高。此外，细胞活力染色发现，在缺氧/复氧条件下，DNMT3B抑制剂可增强心肌细胞活力。这些结果均提示，在缺氧后处理下，DNMT3B介导的miR-30a启动子DNA甲基化水平降低，从而上调miR-30a表达，miR-30a通过抑制BECN1介导的自噬发挥心肌保护作用。该发现支持DNA低甲基化会导致基因不稳定和转录激活，而DNA高甲基化会导致基因沉默这一观点。这为进一步探究miRNA抗MIRI的心肌保护作用机制提供了新方向，而且为减轻I/R引起的心肌损伤提供了潜在的治疗靶点。

2.3 促肾上腺皮质激素释放激素受体2(corticotropin releasing hormone receptor 2, CRHR2)CRHR2是蛋白质编码基因。该基因编码的蛋白质属于G蛋白偶联受体2家族，是促肾上腺皮质激素释放激素受体的亚家族。 该受体对促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)具有很高的亲和力，并与CRH相关肽(如尿皮质素)结合[31]。CRHR2主要分布于心脏，该受体可能参与介导心血管稳态[32]。Urocortin(UCN)是CRH家族中的一种肽，已经证实具有抗I/R损伤的心肌保护作用[33]。大量研究表明，雌激素通过调节内源性因子发挥心脏保护作用。如雌激素可增加热休克蛋白的表达，减少活性氧的产生，抑制促炎基因表达，从而保护心肌细胞免受缺血性损伤[34]。研究证实，雌激素维持心肌CRHR2表达，增强UCN诱导的抗I/R损伤的心脏保护作用。维持CRHR2表达水平对内源性UCN发挥心脏保护作用至关重要[35]。CRHR2近端启动子包含53个CpG位点，这提示甲基化可能会调节CRHR2表达。Cong等[35]进一步研究卵巢切除术和雌激素替代疗法是否影响甲基化。结果表明，在假手术组、卵巢切除组、卵巢切除联合雌激素替代疗法组之间CRHR2 CpG岛中的每个CpG位点甲基化频率差异明显。与假手术组相比，卵巢切除组中7个CpG位点DNA甲基化频率显著增加。提出雌激素可能通过表观遗传机制调控基因表达从而发挥心肌保护作用。该团队在2014年证明在心肌细胞中雌激素通过DNA甲基化调节CRHR2表达[36]，这为了解雌激素的心脏保护作用机制提供了新的见解。

2.4 蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)PKC是磷脂依赖性Ca2+激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶。蛋白激酶C是信号转导途径的主要介质,也是细胞增殖、分化、凋亡等生理过程的关键调节因子[37]。PKC激活会触发许多细胞内事件，这些事件会影响心脏的多个生理过程，包括心率，收缩和舒张功能。最近研究表明PKC的激活与多种心血管疾病的病理生理有关。心肌缺血预处理释放的内源性介质(如腺苷)通过作用于G蛋白偶联受体启动细胞内信号转导途径，从而通过二酰基甘油激活PKC，随后，活化的PKC磷酸化第二个效应蛋白发挥心脏保护作用。PKC有11个亚型，其中PKC-α, PKC-β, PKC-ε, PKC-ζ在胎儿心脏中高度表达。研究证实PKC-ε在缺血性心肌病中发挥重要作用[37]。然而，PKC-ε如何参与心肌保护作用的生理机制仍不清楚。有研究表明，母体缺氧会导致胎儿心脏PKC-ε启动子甲基化以及基因表达模式发生表观遗传抑制，从而雄性子代心脏对缺血再灌注损伤的敏感性增加[38-39]。为进一步研究缺氧诱导因子1或ROS介导缺氧诱导的PKC-ε基因抑制的分子机制，该团队利用妊娠期大鼠缺氧模型以及离体胎鼠心脏组织和大鼠胚胎心肌细胞缺氧模型进行验证。结果表明，缺氧导致H9C2心肌细胞和胎鼠心脏ROS生成增加，使用ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸可抑制缺氧介导的SP1结合位点的甲基化，并且恢复PKC-ε启动子与SP1结合，提示缺氧产生的ROS在胎鼠心脏PKC-ε启动子DNA甲基化中发挥重要作用。此外，使用甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷抑制缺氧对PKC-ε基因表达下调的影响，从而使PKC-ε和mRNA恢复可控水平，证明了DNA甲基化在缺氧诱导的PKC-ε基因抑制中的表观遗传作用。研究证实ROS介导PKC-ε启动子特定序列转录因子结合位点的CpG甲基化，从而调节PKC-ε基因在胎鼠心脏的表达，导致子代心脏对I/R损伤的敏感性增强。

2.5 冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA binding protein, CIRBP)CIRBP是细胞核RNA结合蛋白家族成员，在冷刺激下，CIRBP从细胞核转移到细胞质调节靶mRNA，抑制细胞凋亡[40]。Liu等[41]通过建立大鼠体外循环模型，发现体外循环期间低温可诱导心脏CIRBP的表达，而抑制此蛋白表达则会导致心脏功能显著受损。该团队进一步通过转基因大鼠、心肌细胞培养等一系列研究发现，长期慢性低氧会诱导心肌细胞发生甲基化的表观遗传学改变，导致CIRBP表达下降，并且丧失对低温的反应性。低温抑制CIRBP表达，可导致体外循环期间心肌组织的泛醌合成障碍、辅酶Q10的合成锐减，最终削弱低温的心肌保护效应。通过在心脏停搏液中补充额外的辅酶Q10可弥补冷刺激后CIRBP下降带来的负面效应。

3 线粒体基因组(mitochondrial DNA, mtDNA)

mtDNA位于线粒体内膜和电子传输链，易受到氧化应激损伤。mtDNA由16.5kb双链DNA组成，无内含子，并且在电子传输链中编码复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ以及tRNA和rRNA。因此，若mtDNA发生任何损伤均可能导致线粒体转录功能异常以及氧化磷酸化功能障碍[42]。Yue等[43]研究发现在大鼠心脏I/R过程中，mtDNA转录水平降低以及mtDNA复制减少，进而导致呼吸链复合物合成减少，抑制线粒体生物发生，最终诱导线粒体功能障碍，而且线粒体功能障碍又诱导ROS生产增加，加重mtDNA损伤，诱发心肌细胞损伤。线粒体是将环境刺激转化为表观遗传调控的重要场所。尽管表观遗传学变化主要与核DNA有关，但研究表明，mtDNA的表观遗传调控影响线粒体功能[44]。线粒体表观遗传学相关研究尚处于起步阶段，需进一步深入分析以揭示mtDNA甲基化对心血管疾病的影响。

4 结 语

尽管目前对MIRI的病理生理和分子机制有大量研究，但是将这些发现应用于临床实践仍然受限。靶基因DNA甲基化影响基因转录，从而参与调节I/R引起的炎症反应、氧化应激、自噬、免疫、细胞凋亡等病理过程。进一步研究表观遗传调控在MIRI中的最新进展有助于我们探索相关靶点，如Pink1，miRNA，CRHR2，PKC，mtDNA等在减轻MIRI中的分子机制。