斑点叉尾鮰出血性败血症的病原鉴定及药敏试验

张超 莫延敬

摘要：【目的】明確重庆市万州区某养殖场斑点叉尾鮰暴发出血性败血症的病因，为实际生产中有效防控该病提供参考依据。【方法】通过常规的细菌分离纯化、生理生化试验、16S rDNA序列和cpn60基因检测、系统进化分析及动物回归感染试验对病原菌进行鉴定，并采用K-B药敏纸片扩散法进行病原菌药敏试验。【结果】从患病斑点叉尾鮰的肝脏、肾脏、脾脏和脑组织中分离获得1株优势菌（WZ1906），革兰氏染色呈阴性，短杆状，两端钝圆;其菌落表面光滑湿润，边缘整齐，直径大小为1～2 mm，呈灰白色至浅黄色;有运动性，氧化酶反应、V-P反应、精氨酸双水解酶试验均呈阳性，能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖，能水解明胶和七叶灵，产生吲哚。WZ1906菌株16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均与嗜水气单胞菌相关基因的核苷酸序列高度同源，其相似性达100%;从基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树也可看出，WZ1906菌株与嗜水气单胞菌聚为一支。以WZ1906菌株回归感染的斑点叉尾鮰均发病死亡，其体表和鳍条基部出血，肝脏、肾脏和脾脏肿大充血，肠道出血，与自然发病斑点叉尾鮰的症状相似，但未观察到明显的肠套叠症状。WZ1906菌株对苯唑西林、大观霉素、克拉霉素、氯霉素、四环素、诺氟沙星、环丙沙星、多粘菌素B、复方新诺明及呋喃妥因等28种药物敏感，对青霉素G、氨苄西林和头孢噻吩已产生耐药性（不敏感）。【结论】引起重庆市万州区某养殖场斑点叉尾鮰出血性败血症的病原菌是嗜水气单胞菌，可选用恩诺沙星、氟苯尼考或复方新诺明等水产类常用抗菌药物进行防治。在实际生产过程中应定期对养殖水体进行养护，科学投喂，从根本上预防斑点叉尾鮰肠套叠的发生，降低其防治难度。

关键词： 斑点叉尾鮰;嗜水气单胞菌;出血性败血症;肠套叠;16S rDNA序列;cpn60基因

中图分类号： S941.429                         文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）09-2287-09

Identification and drug sensitivity test of the pathogen of channel catfish manifested as hemorrhagic sepsis

ZHANG Chao， MO Yan-jing

（Chongqing Three Gorges Vocational College， Wanzhou， Chongqing  404155， China）

Abstract：【Objective】The research was conducted to clarify the etiology of hemorrhagic sepsis of channel catfish in a farm in Wanzhou， Chongqing， and provide reference for the prevention and treatment of the disease in production.【Method】The pathogenic bacteria were identified through routine bacterial isolation and purification， physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequence and cpn60 gene detection， phylogenetic analysis and animal regression infection test. The K-B drug susceptibility disc diffusion method was used to carry out the drug susceptibility test of the pathogen. 【Result】One dominant strain（WZ1906） was isolated from the brain， liver， kidney and spleen of the diseased channel catfish. The isolate was Gram-negative， rod-shaped， both ends were obtuse; the surface of the colony was smooth and moist， with smooth edges， with a diameter of 1-2 mm， off-white to light yellow. The bacteria were motile. Oxidase reaction， V-P reaction and arginine double hydrolase test were positive， the glucose， sucrose， maltose， and lactose could be fermented， gelatin and esculin could be hydrolyzed， indole test was positive. 16S rDNA and cpn60 gene sequencing results had the highest homology with Aeromonas hydrophila， up to 100%. It could also be found that the WZ1906 strain and A. hydrophila clustered together from phylogenetic trees constructed based on the similarity of the 16S rDNA and cpn60 gene sequence. The channel catfish with recurrent infections all fell onset and died. The body surface and the base of the fin rays were congested， the liver and kidneys were enlarged and congested， and the intestinal bleeding. The symptoms were similar to those of the naturally occurring diseased channel catfish， but no obvious symptoms of intussusception were observed. The results of drug susceptibility test showed that the bacteria were sensitive to 28 drugs such as oxacillin， spectinomycin， clarithromycin， chloramphenicol， tetracycline， norfloxacin， ciprofloxacin， polymyxin， enrofloxa-cin， compound trimethoprim and nitrofurantoin， but not sensitive to penicillin G， ampicillin and cefotaxime. 【Conclusion】The pathogen causing channel catfish hemorrhagic sepsis in a farm in Wanzhou， Chongqing is A. hydrophila. Commonly used aquatic antibiotics such as enrofloxacin， florfenicol and compound trimethoprim can be used for prevention and treatment of disease. In the actual production process， the aquaculture water body should be maintained regularly and the fish should be fed scientifically to fundamentally prevent the occurrence of channel catfish intussusception and reduce the difficulty of disease prevention.

Key words： Ictalurus punctatus; Aeromonas hydrophila; hemorrhagic sepsis; intussusception; 16S rDNA sequence; cpn60 gene

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31602201）;Science and Technology Research Project of Chongqing Municipal Education Commission（KJQN201903506）

0 引言

【研究意义】斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）又称沟鲶（Channel catfish），是一种原产于北美洲的大型淡水鱼，隶属于鲶形目（Siluriformes）鮰科（Ictaluri-dae），因具有适应性广、食性杂、抗病力强、生长快及肉质鲜美等优点，已成为我国主要的名特优水产品之一（李林等，2012;严朝晖等，2013）。但随着集约化养殖水平的不断提高，各种病害频繁发生，不仅制约斑点叉尾鮰的健康养殖，还给养殖户带来巨大经济损失（韦昌用等，2014;刘韬等，2016;杨移斌等，2017）。因此，分离鉴定病原微生物并采取有效的防控措施对保障斑点叉尾鮰产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】近年来，从斑点叉尾鮰上分离获得的细菌病原有嗜水气单胞菌（Aeromonas hydro-phila）（周碧君等，2004;童桂香等，2009）、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）（耿毅等，2006;汪开毓等，2006）、爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）（梁万文等，2007）、柱状黄杆菌（F1avobacterium columnare）（刘礼辉等，2008）、鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）（范方玲等，2010）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）（顾泽茂等，2010）、温和气单胞菌（A. sobria）（韦昌用等，2014;杨移斌等，2017）和维氏气单胞菌（A. veronii）（刘韬等，2016;田浪等，2018）。其中，鲍曼不动杆菌病主要表现为肝脏发白;爱德华氏菌病的典型症状为顶骨出现裂缝;鲁氏耶尔森菌病的典型特征为鳔出血;柱状黄杆菌感染主要引起鳃组织腐烂;嗜麦芽寡养单胞菌及其他气单胞菌属病原菌感染的主要症状为全身广泛性出血。从临床症状来说，除鲍曼不动杆菌外，其他各类病原均能引起斑点叉尾鮰不同程度的出血症状，且常伴有肠套叠现象，给疾病治疗带来极大困难。2009年美国阿拉巴马州西部和密西西比州东部养殖的斑点叉尾鮰发生大面嗜水气单胞菌原发性感染，造成数千吨的商品鱼死亡（Jubirt et al.，2015;Zhang et al.，2016a）。此外，李艳和等（2010）从患病斑点叉尾鮰中分离获得5株病原菌[3株嗜水气单胞菌和2株豚鼠气单胞菌（A. caviae）];Mohammed和Peatman（2018）研究发现副乳链球菌（Streptococcus parauberis）、腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和维氏气单胞菌混合感染斑点叉尾鮰的现象。可见，2种或2种以上病原菌混合感染在斑点叉尾鮰养殖中较普遍，对其病害诊治和防控提出了新挑战，在生产实践中应引起高度重视。针对鱼类细菌性疾病，目前生产上主要采用外用消毒剂结合内服抗菌药物的方法进行治疗，而预防此类疾病的根本措施是保持良好的水质环境。【本研究切入点】出血性败血症是近年来斑点叉尾鮰养殖过程中的常见病害，其主要症状表现为全身广泛性出血，并发肠套叠，但不同地区的病原分离鉴定结果差异明显。2019年6—7月重庆市万州区某养殖场的斑点叉尾鮰在雨后出现大量死亡，临床症状表现为头部和鳍基部出血，内脏广泛性出血，伴有严重的肠套叠现象，为典型的细菌性感染;病鱼平均体重85.0 g/尾，7日内死亡量从开始的2～3尾剧增至200多尾，病程持续1个多月，累积死亡率为30%～40%，与已报道斑点叉尾鮰细菌性疾病的症状和病程（蔡焰值等，2010;Zhang et al.，2016b;Abdelhamed et al.，2017;Baumgartner et al.，2017）存在差异，因此有必要进一步明确其发病原因并科学用药治疗。【拟解决的关键问题】对重庆市万州某养殖场患出血性败血症的斑点叉尾鮰进行病原菌分离鉴定及药敏试验，旨在查找出斑点叉尾鮰的发病原因，为实际生产中有效防控该病提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

患病斑点叉尾鮰取自重庆市万州區某养殖场;健康斑点叉尾鮰购自当地水产品市场，暂养7 d后，随机挑选健康斑点叉尾鮰进行回归感染试验。普通营养琼脂培养基、革兰氏染色液、药敏检测试剂盒及细菌微量生化鉴定管等购自杭州天和微生物试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒和DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

1. 2 病原菌分离纯化

无菌操作下挑取典型症状病鱼的肝脏、肾脏、脾脏和脑组织，划线接种于普通营养琼脂培养基上，28 ℃恒温培养箱中倒置培养24～48 h，挑选形态大小一致的优势菌落，重复划线传代2～3次纯化培养。纯化后的菌落转移至普通营养琼脂斜面培养基上，4 ℃冰箱保存备用（杨移斌等，2017）。

1. 3 病原菌形态特征观察及其生理生化特性鉴定

参照革兰氏染色说明进行染色，光学显微镜下观察病原菌的形态特征。同时，参照细菌生化微量鉴定管说明和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）对病原菌进行生理生化特性鉴定。

1. 4 16S rDNA和cpn60基因序列分析

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待检菌株的DNA。16S rDNA序列扩增引物设计参照Ucko等（2002）、石存斌等（2009）的方法，上游引物为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3'，下游引物为5'-AAG GAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应体系50.0 μL：10×PCR缓冲液5.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）5.0 μL，dNTP（10 mmol/L）0.8 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1.2 μL，DNA模板5.0 μL，无菌双蒸水补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性10 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。cpn60基因扩增引物设计参照Mi?ana-Galbis等（2009）的方法，上游引物为5'-GAAATYGAACTG GAAGACAA-3'，下游引物为5'-GTYGCTTTTTCC AGCTCCA-3';PCR反应体系及扩增程序同16S rDNA序列。PCR扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶回收后克隆至T载体上，并挑选阳性质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果与GenBank已公布的参考序列进行BLAST比对分析，利用ClustalX 1.81进行多重序列匹配和聚类分析，并以MEGA 4.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。

1. 5 回归感染试验

选取60尾健康斑点叉尾鮰（平均体重85.0 g/尾）随机分为4组（2组为攻毒组，2组为对照组）。调整菌悬液浓度至1.0×108 CFU/mL，攻毒组每尾斑点叉尾鮰胸鳍基部注射0.2 mL菌悬液，对照组则注射等量生理盐水。攻毒后将试验鱼置于水温25～30 ℃的养殖箱中饲养，每天观察并记录其发病及死亡情况，持续观察2周。同时对濒临死亡或已死亡试验鱼再次进行剖检和病原菌分离鉴定。

1. 6 药敏试验

采用K-B药敏纸片扩散法进行病原菌药敏试验。取1.0×108 CFU/mL菌悬液0.2 mL均匀涂布于普通营养琼脂培养基上，等距离贴上不同药物的药敏纸片，28 ℃恒温培养箱倒置培养24 h后观察并记录抑菌圈直径，根据药敏纸片说明判定其敏感性。

2 结果与分析

2. 1 自然发病特点及临床症状

重庆市万州某养殖场的斑点叉尾鮰在雨后发病，发病时池塘平均水温30 ℃，7日内的发病死亡量从开始的2～3尾剧增至200多尾，病程持续1个多月，累积死亡率为30%～40%。临床症状：病鱼的头部、口腔和胸鳍基部出血，眼球突出（图1-A）;剖检可见肝脏暗红，肾脏和肠道充血，脾脏肿大呈酱黑色，肠壁稀薄，肠套叠严重（圖1-B），呈典型的败血症症状。

2. 2 病原菌的形态特征

从患病斑点叉尾鮰的肝脏、肾脏、脾脏和脑组织中均能分离到菌落形态特征一致的单一株菌，命名为WZ1906。其菌落呈圆形，灰白色至浅黄色，表面光滑湿润，边缘整齐，直径大小为1～2 mm（图2）。革兰氏染色呈阴性，短杆状，两端钝圆，为单个或成对排列，无芽孢和荚膜（图3）。

2. 3 病原菌的生理生化特性

由表1可知，WZ1906菌株具运动性，其氧化酶反应、V-P反应、精氨酸双水解酶试验均呈阳性，能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖，能水解明胶和七叶灵，产生吲哚。WZ1906菌株的生理生化特性与嗜水气单胞菌TE090214株（童桂香等，2009）和AHIA04株（李艳和等，2010）相似。

2. 4 16S rDNA和cpn60基因序列分析结果

16S rDNA序列和cpn60基因的PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到约1500和750 bp的清晰目的条带（图4），与预期结果相符。获得的序列经BLAST比对分析，结果显示，16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均与嗜水气单胞菌相关基因的核苷酸序列高度同源，其相似性达100%。从基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树（图5和图6）均可看出，WZ1906菌株与嗜水气单胞菌聚为一支。

2. 5 回归感染试验结果

攻毒组斑点叉尾鮰在人工攻毒感染2 d后，出现活力下降、游动无力现象，其体表和鳍条基部出血（图7-A），5 d内的累计发病鱼占攻毒总数的90%，而注射无菌生理盐水的对照组斑点叉尾鮰未见任何异常（表2）。剖检发病死亡斑点叉尾鮰可见肝脏、肾脏和脾脏肿大充血，肠道出血（图7-B），与自然发病斑点叉尾鮰的症状相似，但未观察到明显的肠套叠症状。再次分离获得的菌株与WZ1906菌株的形态特征、生理生化特性及16S rDNA和cpn60基因序列分析结果一致，说明WZ1906菌株即为斑点叉尾鮰出血性败血症的致病菌。

2. 6 药敏试验结果

35种抗菌药物的敏感试验结果（表3）表明，WZ1906菌株对苯唑西林、大观霉素、克拉霉素、氯霉素、四环素、诺氟沙星、环丙沙星、多粘菌素B、复方新诺明及呋喃妥因等28种药物敏感，对青霉素G、氨苄西林和头孢噻吩已产生耐药性（不敏感）。

3 讨论

I型伴侣蛋白cpn60为高度保守蛋白，近年来常用于物种系统进化分析及种间鉴定。已有研究表明，采用cpn60基因序列对气单胞菌属细菌的鉴定效率明显高于16S rDNA序列（Hill et al.，2004;Mi?ana-Galbis et al.，2009;Guo et al.，2016;Navarro and Martíne-Murcia，2018）。本研究对分离自患出血性败血症斑点叉尾鮰的WZ1906菌株进行分子生物学鉴定，分别扩增其16S rDNA序列和cpn60基因，经BLAST比对分析，发现16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均与嗜水气单胞菌相关基因的核苷酸序列高度同源，其相似性达100%。从基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树也可看出，WZ1906菌株与嗜水气单胞菌聚为一支。综合WZ1906菌株的形态特征、生理生化特性及回归感染试验结果，可确定嗜水气单胞菌即为斑点叉尾鮰出血性败血症的致病菌。

嗜水气单胞菌在自然界的分布十分广泛，隶属于弧菌科（Vibrionaceae）气单胞菌属（Aeromonas），为典型的条件致病菌，且多为继发感染，是淡水鱼类细菌性败血症的主要病原，几乎能侵染所有的淡水鱼类，给水产养殖业造成巨大经济损失（Ardó et al.，2010;王权和朱光来，2012;Zhang et al.，2016a）。此外，从各地患出血症斑点叉尾鮰检测出的致病菌存在明显差异。在贵州乌江（周碧君等，2004）和广西天峨（童桂香等，2009）检测出的致病菌为嗜水气单胞菌;在四川成都检测出的致病菌为嗜麦芽寡养单胞菌（耿毅等，2006）;在广西龙州（韦昌用等，2014）、湖北仙桃（杨移斌等，2017）和贵州罗甸（田浪等，2018）等地检测出的致病菌为温和气单胞菌;在河南中牟检测出的致病菌为维氏气单胞菌（刘韬等，2016）;在湖北省宜都和长阳检测出爱德华氏菌和嗜水气单胞菌混合感染（刘堂水等，2006）;在安徽富煌则发现是嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌混合感染（李艳和等，2010）。本研究从重庆市万州某养殖场患出血性败血症的斑点叉尾鮰中分离获得嗜水气单胞菌，结合贵州乌江（周碧君等，2004）和广西天峨（童桂香等，2009）两地斑点叉尾鮰的发病时间（2—3月），推测本病例是投喂量变化引起的继发感染，而美国斑点叉尾鮰暴发的嗜水气单胞菌病为原发性感染（Zhang et al.，2016a）。可见，不同养殖模式下斑点叉尾鮰对气单胞菌属的致病菌均具有易感性，但不同地区的病原流行种类及其他流行病学存在明显差异。

本研究的药敏试验结果表明，分离自患出血性败血症斑点叉尾鮰的嗜水气单胞菌对头孢哌酮、卡那霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星及复方新诺明等药物敏感，与周碧君等（2004）、童桂香等（2009）、李艳和等（2010）的研究结论基本相同。童桂香等（2009）研究发现斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌对氨苄青霉素、头孢唑林、头孢拉定、庆大霉素、土霉素、四环素和氟苯尼考已产生耐药性;李艳和等（2010）研究表明斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌对青霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、头孢肤肟、四环素、先锋霉素V和先锋霉素VI等药物不敏感（耐药）。在本研究中，斑点叉尾鮰嗜水气单胞菌对大多数抗菌药物敏感，仅对青霉素G、氨苄西林和头孢噻吩具有耐药性，究其原因可能是菌株区域性差异所致（陈言峰等，2014）。2019年9月农业农村部发布了最新的《水产养殖用药明白纸》，仅有12种抗菌药物可用于食用水生动物的养殖生产，即氟苯尼考、甲砜霉素粉、恩诺沙星粉、氟甲喹粉、硫酸新霉素粉、盐酸多西环素粉、维生素C磷酸酯镁、盐酸环丙沙星预混剂、复方磺胺二甲嘧啶粉、复方磺胺甲噁唑粉、复方磺胺嘧啶粉和磺胺间甲氧嘧啶钠粉;而氯霉素、克拉霉素、万古霉素、克林霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、呋喃唑酮、利福霉素、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢哌酮、头孢噻肟及头孢曲松等药物在水生食品动物中已禁止使用。因此，斑點叉尾鮰嗜水气单胞菌的临床防治宜选用氟苯尼考、恩诺沙星或复方磺胺甲噁唑粉等药物。

在实际生产中，养殖品种单一、池塘负载过高、水质恶化及饲料营养配比不合理等均是造成疾病频发的主要因素（陈昌福，2007;安树伟等，2019）。单纯的嗜水气单胞菌感染防治并不困难，但并发或继发严重肠套叠时给治疗带来极大挑战。在本研究中，自然发病斑点叉尾鮰的典型特征为嗜水气单胞菌感染并发肠套叠症状，但回归感染的斑点叉尾鮰并未出现与自然发病相似的肠套叠症状，与童桂香等（2009）的研究结果相似。结合相关文献报道及临床案例分析，推测鱼类肠套叠症状是鱼类体质、饲料、养殖环境及病害等综合因素影响的结果，因此，在实际生产过程中应定期对养殖水体进行养护，科学投喂，从根本上预防鱼类肠套叠的发生。

4 结论

引起重庆市万州区某养殖场斑点叉尾鮰出血性败血症的病原菌是嗜水气单胞菌，可选用恩诺沙星、氟苯尼考或复方新诺明等水产类常用抗菌药物进行防治。在实际生产过程中应定期对养殖水体进行养护，科学投喂，从根本上预防斑点叉尾鮰肠套叠的发生，降低其疾病防治难度。

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（責任编辑 兰宗宝）