eNOS与PKG-1在野百合碱所致大鼠右心室重构中的作用

任星桥，李晓彤，林小英，曾凡群，李叶丽，杨丹莉

(遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室暨遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563099)

右心室重构主要表现为心脏形态扩大，右心室壁厚度增加，心肌细胞肥大、凋亡等。研究表明，肺动脉高压疾病与右心室重构的发生密切相关[1]，随着肺动脉压力升高，引起右心室后负荷加重，继发右心室重构，严重可发展为右心衰竭，甚至死亡。野百合碱(Monocrotaline，MCT)诱导的右心室重构模型是目前常用于研究心脏右心室重构的病理模型[2]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一种内源性气体信号分子，研究表明NO可松弛血管，维持血管张力，改善心肌收缩力并调节心脏氧耗[3]。在心肌细胞内，NO经内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化L-精氨酸产生，可以活化可溶性鸟苷酸环化酶，生成环磷酸鸟苷，激活蛋白激酶G1(Protein kinase G1，PKG-1)，产生舒张血管，抑制心肌细胞肥大等多种作用。已有研究表明，通过上调eNOS可减轻血管紧张素Ⅱ诱导的H9C2心肌细胞肥大；通过上调PKG-1的表达可改善去氧肾上腺素所诱导的乳鼠心肌细胞肥大；上调PKG活性可减轻腹主动脉缩窄术所致新西兰家兔左心室的舒张功能障碍[4-6]。但PKG-1在MCT诱导的右心室重构中的作用鲜有报道。本研究旨在探讨eNOS和PKG-1在MCT所致大鼠右心室重构中的作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 MCT(产品编号：C2401-1G，Sigma公司)；BCA法蛋白定量试剂盒(产品编号：GK5012，上海捷瑞生物工程有限公司)；eNOS小鼠单克隆抗体(产品编号：ab76198，abcam公司)；PKG-1兔单克隆抗体(产品编号：#3248，Cell Signaling公司)；β-actin兔多克隆抗体(产品编号：AF7018，Affinity公司)，HRP标记山羊抗兔IgG(产品编号：S0001，Affinity公司)；HRP标记山羊抗小鼠IgG(产品编号：SA00001-1，Proteintech公司)。

1.2 仪器 PowerLab/8SP生物监测仪(澳大利亚AD instruments公司)；光学显微镜及照相系统(日本Olympus公司)；5417R离心机(德国Eppendorf公司)；Supply Mini-Protean3电泳仪(美国BIO-RAD公司)；Mini Trans-Blot转移系统(美国BIO-RAD公司)；ChemiDoc成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.3 实验动物及分组 180～200 g雄性SD大鼠18只，无特定病原体(Specific pathogen-free animal，SPF)级，购买于长沙天勤生物技术有限公司[许可证号：SCXK(湘)2014-0011]。经SPF级动物房适应性喂养1周，饲养条件：相对恒定室温19～25 ℃，相对湿度40%～70%，将所有SD大鼠随机分为正常对照组(Control组，n=8)和模型组(MCT组，n=10)。其中MCT组大鼠采用颈背部一次性皮下注射MCT(55 mg/kg)，建立右心室重构模型，Control组大鼠同MCT组方法注射等体积生理盐水。所有大鼠每日给予等量维持饲料及等体积双蒸水。

1.4 实验方法

1.4.1 血流动力学检测 造模28 d后，大鼠称重，采用右心导管术检测右心室压。大鼠颈部剪去毛发，剪开右侧皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉，游离锁骨下静脉。将连接压力传感器的导管慢慢推入右侧锁骨下静脉，经右心房插入右心室，采集右心室压力波形。

1.4.2 大鼠右心室质量指数的测定 血流动力学检测后摘取心脏，迅速置于预冷的生理盐水中清洗，分离右心室游离壁，滤纸蘸干水分后，称重记录，计算右心室质量指数=右心室质量/体重。

1.4.3 H&E染色 取大鼠右心室组织置于4%甲醛溶液中，固定48 h。脱水、石蜡包埋、制备组织切片，进行H&E染色，于Olympus光学显微镜下观察右心室病理学变化。

1.4.4 Western Blot检测大鼠右心室组织eNOS和PKG-1蛋白水平 称取大鼠右心室组织约100 mg，剪碎，加入1 mL裂解液(RIPA裂解液：PMSF溶液：蛋白磷酸酶抑制剂=100∶1∶1)，使用匀浆器于冰上进行组织匀浆，于冰上静置裂解30 min，4 ℃、12 000 rpm离心15 min，吸取上清液。BCA法测定上清液的蛋白含量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶(上层5%浓缩胶，下层8%分离胶)，蛋白样品经电泳分离后，使用半干转印槽转移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶摇床室温封闭3 h，TBST洗去牛奶(每次10 min，共3次)，4 ℃过夜孵育一抗(16 h以上)：eNOS(1∶1 000)、PKG-1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，TBST洗膜，室温孵育二抗(1∶5 000)40 min、TBST洗膜后使用化学发光试剂(ECL)，于成像系统获取图像。

1.5 统计学分析 本实验采用SPSS 20.0软件进行数据分析，Graphpad prism 5软件进行绘图，结果以均数±标准误(mean±SEM)表示，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠右心室最大压的变化 造模后第28天，与Control组相比，MCT组大鼠右心室最大压升高72.4%(P<0.05，见图1)。

#：vs Control，P<0.05;n=5～6。图1 大鼠右心室最大压变化

2.2 大鼠一般状况、体重、右心室质量指数变化 Control组大鼠毛色光泽、呼吸平稳、体重逐渐增加；MCT组大鼠毛色发暗、呼吸急促、活动和进食减少、体重逐渐减轻。造模后第28天，与Control组相比，MCT组大鼠体重明显降低(P<0.05)，右心室质量指数明显升高(P<0.05，见表1)。期间MCT组大鼠自发性死亡4只，Control组大鼠无自发性死亡。

表1 大鼠体重和右心室质量指数的变化(n=6～8)

2.3 大鼠右心室组织病理学变化 H&E染色发现，Control组大鼠右心室无明显病理学损伤，其心肌细胞排列有序，细胞核形态正常；MCT组大鼠右心室心肌细胞出现排列紊乱，心肌细胞肥大，炎性细胞浸润，心肌细胞间质增加，部分心肌细胞胞核宽大、形态不规则(见图2)。

A:Contol；B:MCT。图2 大鼠右心室病理变化(400×)

2.4 大鼠右心室组织eNOS蛋白表达的变化 Western blot结果发现，与Control组相比，MCT组大鼠右心室组织eNOS蛋白表达下调52.3%(P<0.05，见图3)。

#：vs Control，P<0.05；n=4。图3 大鼠右心室eNOS蛋白表达的变化

2.5 大鼠右心室组织PKG-1蛋白表达的变化 Western blot结果发现，与Control组相比，MCT组大鼠右心室组织PKG-1蛋白表达下调44.1%(P<0.05，见图4)。

#：vs Control，P<0.05；n=4。图4 大鼠右心室PKG-1蛋白表达的变化

3 讨论

右心室肥大是右心室负荷过重引起的心室腔扩张，心肌收缩力减弱，多见于肺动脉高压、先天性心脏病、慢性肺源性心脏病、风湿性心脏病等疾病。MCT是一种吡咯烷生物碱，主要存在于猪屎豆属植物中。MCT有明显的肺毒性，其肺毒性是MCT经肝代谢后生成野百合碱吡咯，进入体内破坏肺动脉内皮细胞，导致肺动脉平滑肌增殖，肺动脉压升高，继发右心室重构，严重可发展为右心衰竭，甚至死亡[7]。本研究选用MCT颈背部一次性皮下注射建立右心室重构模型。本研究结果显示，与Control组相比，MCT组大鼠体重明显减轻，右心室质量指数和右心室最大压明显升高；右心室心肌细胞出现排列紊乱，部分心肌细胞细胞核宽大、形态不规则，炎性细胞浸润，表明右心室重构模型构建成功，与文献报道相符[8-9]。

生理性NO是细胞内重要信使分子，参与调节心血管系统、外周和中枢神经系统及免疫系统等多种功能。eNOS具有合成NO的能力，NO激活细胞浆中可溶性鸟苷酸环化酶，生成环磷酸鸟苷，进而激活PKG，使细胞内游离Ca2+浓度降低，对心脏起到一定保护作用。PKG又称环磷酸鸟苷依赖型蛋白激酶，有PKG-1和PKG-2两种类型，其中PKG-1主要位于细胞质基质，且只有PKG-1在心血管组织中表达[10-11]。PKG-1通过扩张血管、抑制血小板聚集以及对心肌细胞的负性肌力作用保护心血管系统。研究表明，上调eNOS水平可改善异丙肾上腺素所致心衰大鼠模型的左心室重构；玉郎伞MHBFC通过上调eNOS可改善腹主动脉变窄术诱导的大鼠左心室重构[12-13]。另有报道指出，左心室重构的发生与缺乏PKG密切相关；PKG活性降低可导致心肌细胞肥大[6,14]。因此，我们推测下调eNOS，进而下调PKG-1的表达可能参与右心室重构的发生。本研究结果显示，与Control组大鼠相比，MCT组大鼠右心室组织中eNOS和PKG-1蛋白的表达明显降低，这说明在MCT诱导的大鼠右心室重构的过程中，eNOS和PKG-1蛋白的表达被抑制。

综上所述，eNOS和PKG-1表达的下调可能参与了MCT诱导的大鼠右心室重构。