血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP联合对非小细胞肺癌的诊断价值

王 娟，潘 鑫，徐永茂

(陆军第七十一集团军医院 1. 血液内分泌科,2.肿瘤血液科,江苏 徐州 221009)

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因[1]，5年生存率低于15%[2]。肺癌中约85%为非小细胞肺癌[3]。诊断生物标记物的使用可以帮助识别早期非小细胞肺癌患者，无创且易于评估的液体活检成为新生物标志物的来源[4]。外泌体是衍生自多囊泡体的小膜囊泡，通过胞吐作用将其组成性地或在细胞活化后释放到细胞外空间中[5]。外泌体包含来自其起源细胞的生物活性物质，包括核酸和蛋白质，并且已经表明它们可能在细胞间通讯中发挥作用[6]。Sandfeld-Paulsen B等人[7]通过蛋白质组学发现非小细胞肺癌患者血清外泌体内纽约食管鳞状细胞癌抗原-1(New York-esophageal-1,NY-ESO-1),Alix,胎盘碱性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)的表达水平明显高于健康志愿者。但是血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP是否能够应用于非小细胞肺癌患者的诊断仍需探索。本文针对上述三种标记物在非小细胞肺癌患者的诊断中的价值进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2018年2月至2020年2月本院收治的早期非小细胞肺癌(Ⅰ期和Ⅱ期)患者100例为肺癌组；男65例，女35例；年龄27～68岁；平均年龄(52.53±24.64)岁。纳入同期本院收治的肺部良性患者100例作为良性组；男61例，女39例；年龄34～81岁；平均年龄(55.32±23.05)岁。其中，肺炎性假瘤50例，间质性肺炎22例，肺结核10例，肺脓肿8例，钙化结节5例，炎性结节5例。非小细胞肺癌患者100例和肺部良性疾病患者100例均经本院诊断证实。排除标准：①严重心、肝、肾功能损害者；②长期使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者；③患有精神疾病者；④患有其他癌症者。同时，纳入同期在本院体检的健康者100例为对照组；男64例，女36例；年龄33～79岁；平均年龄(54.65±26.10)岁。各组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 外泌体的分离和蛋白的检测

采取早期非小细胞肺癌患者、肺部良性疾病患者、体检健康者的清晨肘前静脉血6 mL。使用广州捷威斯生物科技有限公司的外泌体纯化试剂盒(BB-3951-1)进行外泌体的分离。将分离的外泌体超声破膜后，以酶联免疫吸附试验检测NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达量。以CD63作为内参。CD63检测试剂盒购自广州杰特伟生物科技有限公司(货号：E9307h)。NY-ESO-1检测试剂盒购自北京启维益成科技有限公司(货号：abx433062)。Alix检测试剂盒购自北京百诺威生物科技有限公司(货号：ABC1435)。PLAP检测试剂盒购自上海机纯实业有限公司(货号：ml000475)。

1.3 统计学分析

SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料满足方差齐性和正态分布，多组间比较采用one-way ANOVA检验。应用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分析NY-ESO-1,Alix,PLAP检测非小细胞肺癌的临床诊断价值。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达水平

三组受试人员血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达水平存在显著差异(P<0.05)，且NY-ESO-1,Alix,PLAP分别在肺癌组中的表达高于良性组和对照组，良性组又高于对照组，说明血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达水平与肿瘤的恶性程度有关，见表1。

表1 三组受试者血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达水平 (ng/L)

2.2 早期非小细胞肺癌患者与肺部良性疾病患者血清外泌体ROC曲线、灵敏度、特异度

为了评估血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP在早期非小细胞肺癌患者与肺部良性疾病患者中的诊断价值，绘制100例早期非小细胞肺癌患者和100例肺部良性疾病患者的ROC曲线(图1)。NY-ESO-1的阳性临界值189.1(ng/L)，其诊断灵敏度为98%，特异度为78%；以Alix的阳性临界值633.1(ng/L)，其诊断灵敏度为95%，特异度为80%；以PLAP的阳性临界值45.42(ng/L)，其诊断灵敏度为90%，特异度为90%。Alix曲线下面积大于NY-ESO-1和PLAP，说明就单向诊断而言，早期非小细胞肺癌患者与肺部良性疾病患者血清外泌体中Alix诊断的效能高于NY-ESO-1和PLAP。见图1和表2。

图1 早期非小细胞肺癌患者与肺部良性疾病患者血清外泌体ROC曲线、灵敏度、特异度

2.3 早期非小细胞肺癌患者与健康体检者血清外泌体ROC曲线、灵敏度、特异度

为了评估血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP在早期非小细胞肺癌患者与健康体检者中的诊断价值，绘制100例早期非小细胞肺癌患者和100例健康体检者的ROC曲线(图2)。以NY-ESO-1的阳性临界值91.03(ng/L)，其诊断灵敏度为95%，特异度为95%；以Alix的阳性临界值367.8(ng/L)，其诊断灵敏度为94%，特异度为95%；以PLAP的阳性临界值7.197(ng/L)，其诊断灵敏度为95%，特异度为92%。NY-ESO-1曲线下面积大于Alix和PLAP，说明就单向诊断而言，早期非小细胞肺癌患者与健康体检者血清外泌体中NY-ESO-1诊断的效能高于Alix和PLAP。见图2和表3。

图2 早期非小细胞肺癌患者与健康体检者血清外泌体ROC曲线、灵敏度、特异度

表2 早期非小细胞肺癌患者与肺部良性疾病患者血清外泌体ROC曲线、灵敏度、特异度

表3 早期非小细胞肺癌患者与健康体检者血清外泌体ROC曲线、灵敏度、特异度

2.4 血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP对非小细胞肺癌的联合诊断

患有非小细胞肺癌的为真阳性，未患有非小细胞肺癌的为真阴性。以NY-ESO-1的阳性临界值189.1(ng/L)、Alix的阳性临界值633.1(ng/L)、PLAP的阳性临界值45.42(ng/L)为诊断界限，三者全满足者为联合诊断阳性。血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP联合对非小细胞肺癌的诊断的的灵敏度为95.00%(95/100)，特异度为91.00%(182/200)，准确度为92.33%(277/300)。见表4。

表4 血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP对非小细胞肺癌的联合诊断

3 讨 论

肺癌是全球最常见、最致命的恶性肿瘤[8]。其中，非小细胞肺癌患者占85%，其中5年度生存率仍仅为15%。根据每年的低剂量计算机X线摄影筛查进行的国家肺癌筛查试验表明，识别早期肺癌个体有降低死亡率的潜力。但在鉴别良恶性病变有一定的局限性，并且定期进行放射线暴露可能会造成有害影响[9]。因此，开发特异性和非侵入性生物标志物测定对于提高高危人群的识别至关重要肺癌。在本研究中，分离血液中的外泌体后通过酶联免疫吸附实验检测其中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达水平，使用ROC曲线分析发现血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP联合鉴别早期非小细胞肺癌诊断的灵敏度为95.00%，特异度为91.00%，准确度为92.33%。约登指数是评价筛查试验真实性的方法，其数值越大说明筛查实验的效果越好，真实性越好。通过ROC曲线，发现NY-ESO-1,Alix,PLAP的约登指数均大于0.75，说明具有较好的真实性。本研究联合诊断的标准是血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达量均达到阳性临界值才判断为联合诊断阳性，而单个指标的灵敏度和特异度为仅满足自身的阳性临界值，因此联合检测组数据都小于NY-ESO-1,Alix,PLAP的单个指标值。尽管NY-ESO-1,Alix,PLAP均能够作为非小细胞肺癌的潜在标志物，但是其在其他疾病患者的血清外泌体中是否也表达异常仍然未知。如果其它疾病的生物标志物是这三者之一，单个指标的诊断就会有假阳性的结果产生。因此，三者均达到阳性临界值的联合诊断能够减少假阳性的产生。

最近有关外泌体的研究表明它们可能充当癌症的生物标志物。在肺癌中已经研究了它们作为诊断性生物标志物的用途[10]。然而，仅在少数针对细胞外囊泡或外泌体miRNA的小型研究中评估了外泌体作为预后标志物的用途[11]。外泌体表面蛋白很可能反映了非小细胞肺癌的病理过程，但是以往的研究尚未研究过外泌体中蛋白的诊断潜力。本研究通过分离受试人员外泌体发现，3组受试人员血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达水平存在显著差异(P<0.05)。提示外泌体中的蛋白具有诊断潜力。

NY-ESO-1是在许多实体癌中表达的睾丸癌抗原[12]。有研究评估了非小细胞肺癌组织中NY-ESO-1的基因表达，发现它存在于15%～30%的肺癌样本中[13]。Alix，也称PDCD6IP，在胞质分裂的脱落阶段，腔内内体囊泡形成和包膜病毒出芽中在ESCRT途径内起作用[14]。Liu SG等[15]发现在中国汉族人群中，Alix与非小细胞肺癌风险相关。研究表明，这种蛋白的过度表达可以阻止细胞凋亡[16]。因此，PDCD6IP可能在包括NSCLC在内的癌症发展中起关键作用。PLAP是一种催化磷酸单酯水解的金属酶[17]。Wick MR等[18]发现PLAP在女性苗勒氏癌，肠癌和肺癌中异常表达。本研究发现血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP鉴别早期非小细胞肺癌患者与肺部良性疾病患者的灵敏度分别为98%、95%和90%，特异度分别为78%，80%，90%。血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP鉴别早期非小细胞肺癌患者与健康体检者的灵敏度分别为95%，94%，95%，特异度分别为95%，95%，92%。因此，推测血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP对早期NSCLC具有较好的诊断作用。

综上所述，血清外泌体中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表达量检测可作为诊断早期非小细胞肺癌的潜在标志。