脑出血大鼠相关蛋白表达与脑组织水肿和神经功能缺损关系的研究

张 皓，周颖祯

(苏州市中西医结合医院检验科，江苏 苏州 215101)

脑出血(cerebral hemorrhage,CH)发病率每年为万分之一到万分之三，死亡率为30%～50%[1-2]。CH多见于脑组织持续性出血、血肿扩大、血肿周围缺血带、脑水肿、炎症反应等，其中脑水肿和炎症反应是最严重的致病因素[3-4]。脑水肿具有神经毒性，可降低脑神经功能，造成神经功能障碍[5]。炎症级联反应是脑水肿继发性损伤的主要原因。目前临床上以脱水降低颅内压、控制血压、改善营养代谢和防止并发症等对症及支持疗法为主要的治疗方案。凝血酶相关指标如蛋白酶激活受体-1(PAR-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)受体是反应CH后继发性脑损伤的重要指标。研究报道，保护蛋白Mip-1广泛分布于脑组织中，与细胞生长、分化、凋亡和肿瘤的转化具有密切关系[6-7]，但目前对于Mip-1与CH脑组织损伤严重程度的关系报道较少。本研究选取大鼠自体股静脉建立尾状核脑出血模型，研究Mip-1、PAR-1、MMP-9等水平与CH严重程度的关系，旨在为临床CH的诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只(SPF级)，体质量250～280 g，平均(261.3±6.2) g，喂养于23 ℃～25 ℃、相对湿度45%～60%、光照12 h的环境中。

1.2 实验药品、仪器

Ⅳ型胶原酶(sigma公司)，水合氯醛(国家集团化学试剂有限公司批号20111024);引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;SV Total RNA Isolation System(Promega公司);ReverTra-Plus-TM试剂盒(PCR-501)(TOYOBO公司);Go Taq qPCRMasterMix(A6001)(Promega公司);Thermo ScientificRevert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(#K1621)(Thermo公司)；苏木精伊红(HE)染色试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)，石蜡切片机(徕克公司SQ2125)，DAB浓缩型试剂盒(上海基尔顿生物科技有限公司)，鼠抗人Mip-1多克隆抗体(Santa Cruz生物技术公司)，羊抗鼠HRP标记二抗(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 分组及造模方法

术前所有大鼠禁食、禁水，腹腔注射100 g/L(300 mg/kg)水合氯醛进行麻醉，对头、股部皮肤，消毒备用。于右股处切开长约10～15 mm的切口，分离肌肉和神经，暴露出股动脉。将大鼠固定于手术台上，仰卧位，正中切开头皮，以前囟中央为原点，前后0.2 mm范围，在正中线右旁3.5 mm处钻孔至颅骨下硬膜，CH组大鼠将100 μL股动脉血用微量注射器垂直进针以3～10 μL/min缓慢匀速注入大鼠尾状核内，进针深度约5.5 mm，注射完毕，留针5 min，退针。对照组大鼠只进行手术过程，不注射股动脉血。骨蜡封闭骨孔，缝合头皮。

1.4 检测方法

1.4.1 HE染色 分别于造模后3，12，24，72 h，每组各取9只大鼠，100 g/L(300 mg/kg)水合氯醛腹腔内注射麻醉，开胸暴露心脏，从左心室插管至主动脉，右心耳处留出开口，注射200 mL 37 ℃的生理盐水，无血污后，改为注射400 mL的4 ℃的多聚甲醛磷酸盐缓冲液。断头处死大鼠，冠状面以血肿为中心，与2 mm半径范围取脑组织，将其固定在4%多聚甲醛中浸泡12～24 h，依次经过脱水、石蜡包埋后连续冠面切取厚度为3 μm的切片，按照HE试剂盒操作步骤进行HE染色。

1.4.2 脑组织含水量检测 相同操作去除脑组织，去除嗅球及额极前部4 mm的脑组织，以右侧大脑半球中部注射针眼处冠状位切割脑组织，可见在尾状核部位有脑血肿，滤纸擦去脑组织表面水分，取血肿侧脑组织置天平内称取湿质量，然后置100 ℃电烤箱24 h，再迅速测干质量。计算脑含水量(%)=[(湿脑质量-干脑质量)/湿脑质量]×100%。

1.4.3 Western blot检测 简略步骤如下：取少量脑血肿周围组织置于1～2 mL匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块剪碎，加400 μL去污剂裂解液于匀浆器中，并在冰上进行匀浆，裂解30 min后，用移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中，然后在4 ℃条件下，12 000 rpm离心 5 min, 取上清，用BCA试剂盒进行蛋白定量，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳， 转膜、加(1∶1 000)Mip-1，PAR-1，MMP-9的兔抗鼠多克隆抗体(一抗)封闭，4 ℃条件下过夜。第二天，室温放置40 min,PBS洗3次，每次3 min,加二抗(兔抗鼠)，使用凝胶成像系统成像，并用Image J进行半定量分析。

1.4.4 神经功能缺损评分 神经功能评分采用Garcia等制定的评分方法，主要包括笼中自发活动、四肢对称运动、前肢对称外展、爬铁笼壁、躯干对钝棒触及反应、触须对钝棒触及反应，最高评分18分、最低评分3分，分数越低表示，神经功能障碍越严重。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠脑组织形态学观察

图1A为对照组各时间段的代表照片，可见脑组织结构清晰、神经细胞排列规则、未见有细胞出现肿胀、核固缩及崩解；图1B、C、D、E分别为CH组大鼠脑组织HE染色造模后3，12，24，72 h的结果，可见出现明显的核固缩、细胞溶解、神经细胞排列紊乱、神经细胞周围被大量的炎性细胞浸润，在造模后72h可见脑组织中大量的液化坏死区域。

图1 脑组织形态学(HE 400×)A：对照组；B、C、D、E：CH组大鼠造模后3，12，24，72 h

2.2 两组大鼠脑组织的水肿情况

CH组大鼠在造模后3，12，24，72 h的脑组织含水量显著高于对照组，且随着时间的增加含水量呈上升趋势(P<0.05，表1)。

表1 两组大鼠脑组织的含水量情况 (%)

2.3 大鼠神经功能缺损评分变化

CH组大鼠在造模后3，12，24，72 h的神经功能缺损评分显著低于对照组，且随着时间的增加呈降低趋势，说明出血对神经功能有损伤作用(P<0.05，见表2)。

表2 两组大鼠神经功能缺损评分变化 (分)

2.4 大鼠脑血肿周围组织中的Mip-1、PAR-1、MMP-9蛋白表达变化

CH组大鼠在造模后3，12，24，72 h的Mip-1、PAR-1、MMP-9蛋白表达均高于对照组，且随着时间的增加呈升高的趋势(P<0.05，表3，图2、图3和图4)。

表3 两组大鼠脑血肿周围组织中的各蛋白表达变化(相对表达量)

图2 两组大鼠脑血肿周围组织中的Mip-1蛋白表达1：3 h；2：12 h；3：24 h；4：72 h

图3 两组大鼠脑血肿周围组织中的PAR-1蛋白表达1：3 h；2：12 h；3：24 h；4：72 h

图4 两组大鼠脑血肿周围组织中的MMP-9蛋白表达1：3 h；2：12 h；3：24 h；4：72 h

3 讨 论

将大鼠自体股动脉血注入至尾状核中创建高血压脑出血模型，该种建模方法较其它建模方法更接近于临床高血压出血，且建模成功率达97.5%[8-9]。本研究结果显示，急性脑出血大鼠脑水肿随着出血时间逐步增加，出血后第三天达到水肿最高峰，与国内外相关文献报道一致[10]。脑出血发生后脑部水含量上升的原因主要与脑出血病理生理性改变相关，脑组织血管受血肿压迫，脑循环障碍，血脑屏障破坏，且血肿分解后产生释放多种活性物质，是导致脑出血后相关神经系统并发症的主要原因。主要表现为，神经细胞坏死凋亡、神经组织中炎症因子浸润、血脑屏障破坏等一系列较严重的继发性脑损伤。脑出血后血管超微结构也严重受损[11]。血肿以绝对水肿体积大于相对水肿体积为主要特点。其原因主要是，血肿中包含的凝血酶、炎症介质等活性物质通过剂量效应加重血肿周围水肿程度。有研究报道，脑出血在脑组织的不同损伤区域及损伤面积大小与不同程度的神经功能缺损症状有关[12]。本研究结果显示，急性脑出血大鼠神经功能损伤评分逐渐降低，且与脑水肿趋势相同，与以往研究报道结果一致。

Mip-1是参与脑出血损伤保护机制中的具有多种生物学功能的核转录因子。有研究显示，大鼠短暂性非损伤性出血Mip-1水平升高[13]。本研究结果显示,与健康组比较，CH组大鼠Mip-1水平显著升高。推测Mip-1参与了减轻脑出血后的脑水肿，起到保护脑组织作用。生理条件下，大脑皮层扣带回、皮质、下丘脑核团、丘脑腹侧、中脑、海马和小脑的神经元，均有PAR-1的表达。凝血酶作为内源性凝血和外源性凝血的共同作用通路，在维持血管内凝血机制中具有重要作用。研究报道大脑基底节出血周边组织中存在凝血酶表达异常升高，其受体PAR-1水平也相应升高[14]。有学者加入凝血酶抑制剂后，减轻凝血酶对出血性大脑的损伤。其机制可能是，凝血酶与受体亲和力降低后，可减弱细胞内三磷酸尿苷和酪氨酸激酶的活性，下调Xa因子(其参与蛋白裂解方式产生凝血酶的重要途径)，进而减轻凝血酶对出血性大脑的损伤程度。邹有瑞等[15]通过研究心源性梗死患者MMP-9表达水平，结果表明MMP-9异常升高可预测NIHSS和梗死灶体积。本研究结果发现，脑出血患者周边组织中MMP-9含量异常升高，可作为评估出血程度和疾病转归的评估指标。

综上所述，CH大鼠脑血肿周围组织中的Mip-1、PAR-1、MMP-9蛋白表达上调，可能与脑组织水肿、神经功能缺损加重有关。