白果粉对小鼠抗疲劳和抗衰老作用研究

张 敏，向晓燕，江雪均，张景勍，刘颖菊、4

（1.重庆医科大学药学院2017级硕士研究生，重庆 400016；2.重庆医科大学药学院重庆高校药物工程研究中心，重庆 400016；3.广州医科大学药学院，广东 广州 511436；4.重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆 400016）

银杏是一种落叶的多年生树［1］，研究结果显示银杏叶、银杏种子含有多种化学成分，其主要有效成分为黄烷醇糖苷、萜内酯、银杏酸、多糖、生物碱等［2］，可用于治疗支气管哮喘［3］、脑卒中［4］、高血压［5］、高脂血症［6］、阿尔茨海默氏症［7］等，银杏其他药用部位（银杏种仁等）也开始被开发利用起来。银杏种仁（俗称“白果”）除含有药用成分外，还含有蛋白质、维生素、脂肪［7］、胡萝卜素等营养成分及微量元素［8］，可药食兼用。白果也含有一些有害成分，如酚酸类化合物可以导致过敏［9］，4'-O-甲基吡哆醇会引起中毒［10］。酚酸化合物之一的银杏酸除具有抗真菌，抗肿瘤等药理作用特性外［11］，还具有胚胎毒性和细胞毒性等，限制了白果的应用，因此需要对白果进行加工处理，以控制其有害成分的含量。本研究用白果粉是以优质的白果为原料，经先进的工艺技术加工制成的粉粒状物，去除有毒成分，保留营养及有效成分。在文献报道的白果药理作用研究的基础上，考察白果粉的抗疲劳和抗衰老作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4周龄清洁级昆明小鼠，45只雄性，5只雌性，体质量为（20±2）g；10个月龄清洁级昆明小鼠，体质量30～35g，60只，雌雄各30只。许可证号SYXK（渝）2018-0003。由重庆医科大学实验动物中心提供。置于温度（22±2） ℃，相对湿度50%～60 %，12 h循环照明的环境中适应性饲养，自由摄食和饮水。

1.2 实验试剂

D-半乳糖（北京鼎国昌盛生物科技有限公司，纯度大于等于98 %），肝（肌）糖原（批号20180122），全血乳酸试剂盒（批号20180503），血尿素氮（批号141318005），超氧化物歧化酶试剂盒（批号20180505），丙二醛试剂盒（批号20180504），单胺氧化酶测定试剂盒（批号20180504）均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 实验仪器

多功能酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司，型号VARIOSKAN LUX），低温离心机（赛默飞世尔科技有限公司，型号ST 16R），MORRIS水迷宫视频分析系统（北京科迪众创有限公司）。

1.4 实验药物

白果粉（江苏东台捷尔银杏科技有限公司，纯度大于99 %）。白果粉制备工艺［12］为原料筛选→剥壳、去壳→漂洗、去皮衣→中间检验→磨浆、过滤→调浆、静置→预糊化→脱水干燥→破碎、筛分→白果粉。白果粉混悬液的制备为分别称取约1g、2g、3g白果粉置于3个烧杯中，分别往烧杯里缓慢加入20 mL蒸馏水，搅拌混匀，配成低、中、高浓度的白果粉混悬液，浓度分别为50 mg/mL、100 mg/mL和150 mg/mL，临用前新配。

1.5 抗疲劳试验

1.5.1 动物分组及给药

4周龄雄性昆明小鼠40只，随机分为白果粉3剂量组（2、4、6g/kg），正常对照组（Normal），每组10只。白果粉3个剂量组灌胃给予相应浓度的白果粉混悬液，正常对照组给予等体积蒸馏水，每日1次，连续28天。

1.5.2 小鼠爬杆实验

有机玻璃棒（长40 cm，直径8 mm）垂直固定于桌面，将小鼠置于有机玻璃棒顶端，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠从开始至双前肢接触杆底平台的时间，第3次小鼠从玻璃棒顶端跌落时终止实验，3次爬杆时间累计为总时间。

1.5.3 小鼠负重游泳实验

最后一次给药60 min后，在小鼠尾部绑上其体质量5%的重物，放入40 cm水深玻璃水缸中，水温为（30±1） ℃。记录小鼠从开始游泳至头部入水持续10 s不能浮出水面为止的时间，作为小鼠力竭游泳时间。

1.5.4 小鼠血乳酸、血尿素氮、肝（肌）糖原水平测定

负重游泳实验结束后，撤去小鼠尾部的重物，将小鼠置于温度为（30±1） ℃水中游泳90 min，眼眶采血，测定血乳酸和血尿素氮。处死小鼠后取肝脏和后腿部的肌肉，经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，-80 ℃保存备用，用于测定肝（肌）糖原。

1.6 抗衰老实验

1.6.1 动物分组及给药

4周龄昆明小鼠10只和10个月龄昆明小鼠60只作为研究对象。10个月龄昆明小鼠，随机分为6组（雌雄各30只），模型组、白果粉3个剂量（2g/kg、4g/kg、6g/kg）组、维生素E组（100 mg/kg）、衰老对照组每组10只，4周龄小鼠（雌雄各5只）为年轻对照组。各给药组灌胃相应药物，年轻对照组、衰老对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，每日1次。小鼠皮下注射1000 mg/kg D-半乳糖（每日1次）建立衰老模型，年轻对照组和衰老对照组皮下注射等体积生理盐水（每日1次）。灌胃及造模均持续28天。

1.6.2 Morris水迷宫实验

给药最后1周，进行Morris水迷宫实验。先进行定位航行实验，测量小鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。在定位航行实验中小鼠学会寻找平台后，进行空间探索实验，考察小鼠对平台空间位置记忆的保持能力，操作步骤为撤掉平台，在测试系统中设置原平台位置为虚拟平台。将每只小鼠依次置于第3象限入水，记录其在120 s内穿越虚拟平台的次数。并记录小鼠从入水到第1次穿越虚拟平台的游泳轨迹图。

1.6.3 体质量记录和胸腺指数、脾脏指数计算

小鼠饲养期间每3天记录1次体质量。

实验结束后，取小鼠胸腺和脾脏，用4 ℃生理盐水洗去浮血，滤纸吸干水分，称重，计算小鼠胸腺指数和脾脏指数，计算公式如下：

脏器指数（g/g）=脏器质量（g）/小鼠体质量（g）×100%

1.6.4 血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA）和脑单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）水平测定

末次给药后，小鼠禁食，自由饮水，24 h后，采血，低温离心后取上层血清，-80 ℃保存。处死小鼠后，取小鼠大脑，生理盐水洗净并滤干，-80 ℃保存，待测定时制备成10%的组织匀浆，按照试剂盒测定血清SOD、MDA和脑MAO。

1.7 统计学处理

用SPSS 17.0统计软件进行分析，实验数据用（±s）表示，组间比较用单因素方差分析，若方差齐，组间比较用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 抗疲劳实验

2.1.1 白果粉对小鼠体质量的影响

白果粉给药期间，各组小鼠体质量变化趋势相同。表明白果粉对小鼠体质量无不良影响。

2.1.2 白果粉对小鼠负重游泳和爬杆时间的影响

如表1所示，白果粉能够增加小鼠负重游泳和爬杆时间。白果粉各剂量组均延长了小鼠的负重游泳时间和爬杆时间，其中白果粉高剂量组小鼠的负重游泳时间和爬杆时间分别较正常对照组小鼠提高了约1.46和4.03倍，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），表明白果粉能增加小鼠的运动耐力。

表1 白果粉对小鼠负重游泳和爬杆时间的影响 （±s）

表1 白果粉对小鼠负重游泳和爬杆时间的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；△△P＜0.01。

组别 例 负重游泳时间（s） 爬杆时间（min）正常对照组 10 361.25± 11.47 2.01±0.60白果粉低剂量组 10 504.20± 50.19 2.86±0.76白果粉中剂量组 10 397.17± 67.06 4.09±0.86白果粉高剂量组 10 889.33±116.41△△ 10.13±2.05△

2.1.3 白果粉对小鼠血液生化参数和糖原的影响

如表2所示，与正常对照组比较，白果粉中、高剂量组都可以减少小鼠运动后血乳酸的产生，且高剂量组乳酸堆积量较正常对照组低（P＜ 0.05）；白果粉对血尿素氮未产生明显影响作用；白果粉能提高小鼠肝糖原和肌糖原含量，其中高剂量组小鼠的肝糖原和肌糖原含量与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），分别较正常对照组增加了约1.98和2.10倍。说明白果粉增加了小鼠的能量储备，可延缓机体疲劳的发生。

表2 白果粉对小鼠血液生化参数和糖原的影响 （±s）

表2 白果粉对小鼠血液生化参数和糖原的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，△P＜0.05；△△P＜0.01。

肌糖原/（mg/g）正常对照组 10 5.66±3.30 11.63±1.57 1.76±0.61 0.46±0.18白果粉低剂量组 10 5.90±1.19 13.02±1.35 2.54±1.25 0.92±0.23白果粉中剂量组 10 3.99±1.15 10.71±1.31 2.47±0.80 0.69±0.31白果粉高剂量组 10 0.86±0.51△ 13.67±2.49 5.24±0.98△ 1.43±0.46△△组别 例 血乳酸/（mmol/L）血清尿素氮/（mol/L）肝糖原/（mg/g）

2.2 抗衰老实验

2.2.1 白果粉对衰老小鼠空间位置记忆保持能力的影响

小鼠空间探索轨迹图和穿越虚拟平台次数结果显示，与年轻对照组和衰老对照组比较，模型组小鼠穿越平台次数减少，空间探索轨迹的趋向性变差。白果粉中、高剂量组可以改善小鼠运动的趋向性和寻找平台的准确性，其中白果粉中剂量组穿越虚拟平台次数较模型组多（P＜0.05），使小鼠空间位置记忆保持能力增强。表明白果粉可以改善衰老小鼠的空间学习记忆能力。

表3 Morris水迷宫小鼠穿越虚拟平台次数 （±s）

表3 Morris水迷宫小鼠穿越虚拟平台次数 （±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05。

组别 例 穿越虚拟平台次数（次）年轻对照组 10 1.91±1.08衰老对照组 10 1.75±1.48模型组 10 0.67±0.75维生素E组 10 1.22±1.23白果粉低剂量组 10 0.67±0.82白果粉中剂量组 10 1.50±0.67△白果粉高剂量组 10 1.67±1.49

2.2.2 白果粉对衰老小鼠体质量的影响

白果粉给药期间，年轻对照组小鼠体质量呈增长的趋势，且变化速度较衰老小鼠体质量变化速度快。模型组小鼠体质量比衰老对照组略低，阳性药物组和白果粉低、中剂量组小鼠的体质量较模型组略高，白果粉高剂量组小鼠体质量较衰老小鼠偏低，有下降的趋势。

2.2.3 白果粉对衰老小鼠脏器指数和生化指标的影响

如表4所示，与年轻对照组比较，衰老对照组和模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数降低。与模型组小鼠比较，白果粉各剂量组均能延缓脾脏、胸腺指数减小。表明白果粉能维持机体的免疫功能，发挥一定的抗衰老作用。衰老对照组和模型组小鼠血清MDA含量增加、脑MAO活性上升，氧自由基增多，机体受到氧化损伤而发生衰老。白果粉使小鼠血清MDA含量和脑MAO活性均低于模型组，低剂量组脑MAO活性显著下降（P＜0.05）。白果粉低、中、高剂量组小鼠的血清SOD活性较模型组均有提高。结果表明，白果粉通过抗氧化作用能够缓冲氧自由基对机体造成的伤害，主要通过减少氧化产物MDA的产生和抑制脑MAO活力。

表4 白果粉对衰老小鼠脏器指数和生化指标的影响 （±s）

表4 白果粉对衰老小鼠脏器指数和生化指标的影响 （±s）

注： 与模型组比较，△P＜0.05。

组别 例 脾脏指数（%） 胸腺指数（%） 血清SOD（U/mL） 血清MDA（umol/L） 脑MAO（U/mgprot）年轻对照组 10 0.38±0.07 0.28±0.04 6708.33±221.57 1.52±0.38 11696.99±1138.71衰老对照组 10 0.26±0.06 0.17±0.03 6189.00±369.29 2.14±0.50 13034.27± 624.87模型组 10 0.24±0.07 0.11±0.03 6279.88±484.19 2.47±0.96 15594.56±1351.67维生素E组 10 0.26±0.05 0.12±0.04 6745.87±167.93△ 1.83±0.35 14852.41±1096.56白果粉低剂量组 10 0.28±0.08 0.14±0.05 6838.13±545.09 1.73±0.46 13188.91±1172.92△白果粉中剂量组 10 0.34±0.09 0.11±0.03 6890.36±384.43 1.61±0.49 13424.77±1506.87白果粉高剂量组 10 0.28±0.04 0.14±0.03 6623.51±362.37 1.72±0.48 13742.84± 848.71

3 讨 论

运动性疲劳是指机体生理过程不能维持其机能在一定水平上和（或）不能维持预定运动强度的状态［13］。衰老是一种复杂的自然现象，表现为细胞和组织结构和功能的退化性改变。D-半乳糖通过增加氧化应激、细胞凋亡、炎症和神经调节、星形胶质细胞和小胶质细胞的活化、脑源性神经营养因子缺乏和抗氧化酶减少等机制损害认知功能，而常用于啮齿动物来模拟自然衰老［14］。研究结果显示，白果粉具有在疲劳模型中增加小鼠的运动耐力，在衰老模型中增强小鼠的空间位置学习记忆保持能力、减轻氧化损伤和延缓免疫器官萎缩的作用。具体表现为使小鼠爬杆和负重游泳时间延长，降低高强度游泳运动中血乳酸水平，并增加肝糖原和肌糖原的储存量。此外，白果粉改善了衰老小鼠在Morris水迷宫实验中寻找平台的能力，延缓了胸腺、脾脏等免疫器官脏器指数的减小，使小鼠体内SOD水平升高，并降低了脑MAO活力和细胞膜过氧化终产物MDA的产生。抗疲劳作用的直接量度是运动耐力的增加［15］，小鼠运动耐力可通过负重力竭游泳实验和爬杆实验等直观反映［14］。血尿素氮是评估机体对高强度运动负荷的承受能力的敏感指标，研究结果显示白果粉对血尿素氮水平未产生明显影响。乳酸是肌肉在进行高强度运动时，从厌氧糖酵解途径获得足够能量的同时产生的副产物，过量乳酸清除的主要途径是用于补充肌肉糖原和在肝脏中通过糖异生将其转化为葡萄糖，然后被保存为肝糖原；运动所需的能量最初来自糖原分解，后来来自肝脏释放的循环糖原。因此本研究结果中乳酸水平降低和肝、肌糖原的储存量增加有利于增强耐力和运动能力［16］，与负重力竭游泳和爬杆实验结果一致。通过Morris水迷宫实验来评判白果粉对衰老小鼠的认知障碍是否有所改善［17］。氧自由基产生增加导致氧化应激是产生衰老的主流学说，SOD作为生物体内存在的天然抗氧化酶能够清除体内氧自由基，MDA是氧自由基作用于生物膜发生脂质过氧化反应的产物，可引起组织和器官衰老，脑MAO活性增加会加快神经系统的老化。免疫功能下降是生物体衰老的重要表现形式［18］，胸腺、脾脏的脏器指数是反应大体形态的重要指标，而器官形态在一定程度上可以反映机体免疫器官的功能状态［18］。

白果粉具有抗疲劳和抗衰老的作用。