浅析抗氧化剂对猪精液保存的影响因素

王 骞，张 群，郭铭晖，王 硕，李雁冰，黄大鹏，魏国生，李井春

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

1 抗氧化剂作用机制

抗氧化剂的抗氧化作用机制有很多种，例如：自由基的吸收剂、氧清除剂、过氧化物分解剂等。首先，抗氧化剂可以抑制自由基产生，并且与已产生的游离的自由基结合反应。另外通过提高抗氧化酶活性，降低ROS含量[1]。同时一些抗氧化剂的还原电位非常低，是氢和中子的给予者，其能在氧化还原反应中与体内产生的ROS形成非常稳定的酚氧自由基，进而阻止精子受氧损伤。超氧自由基在多数的氧自由基中，都有直接消除自由基的作用，增强细胞抗氧化酶的活力，具体抗氧化作用如图1所示。

2 抗氧化剂的种类

2.1 酶类抗氧化剂

抗氧化剂是阻止氧化不良影响的物质，它是一类能帮助捕获并中和自由基，从而去除自由基对细胞及精子损害的物质。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）是精子体内精浆和线粒体中必不可少的最基本的抗氧化剂[2]。超氧化物歧化酶通过催化超氧化物转化为氧气和过氧化氢来保护精子免受超氧化物阴离子的侵害，从而防止过氧化脂质（lipoperoxides，LPO）并提高精子运动能力。过氧化氢酶可以推进过氧化氢的分解，使其分解成水和氧气。所以超氧化物歧化酶和过氧化氢酶都有助于降低精子的氧化损伤程度[3]。

2.2 维生素类抗氧化剂

2.2.1 维生素E

维生素E（α-生育酚）是一种在精子细胞膜中发现的断链型抗氧化剂，它的作用机制不是通过清除自由基来避免脂质过氧化反应，而是通过中和过氧化氢和淬灭自由基来发挥作用，从而阻止链反应产生脂质过氧化物并保护膜免受ROS诱导的损伤。维生素E是一种脂溶性物质，它不溶于水，易溶于丙酮等有机溶质[4]。在冷冻保存过程中，补充维生素E对精子活力、线粒体膜电位和膜完整性有积极作用，具体取决于精子的比例。朱广琴等[5]研究表明：综合各项指标后表明以质量浓度为400 μg/mL维生素E组的效果最好。

2.2.2 维生素C

维生素C是一种水溶性维生素，能清除活性氧，发挥抗氧化作用，提高精子冻融后的精液质量。权富生等[6]研究表明，在无角道塞特绵羊精液的冷冻保存中，稀释液中添加维生素E、维生素C进行精液冷冻，均对冷冻精子起到了保护作用。维生素E可以当作首选抗氧化添加剂，它可以提高精子的成活率和顶体的完整度。实验的结果证实添加4.4 mg/mL的维生素C，精子的成活率可以达到（37.98%）。黄俻华等[7]研究表明，冷冻稀释液中添加600μg/mL的维生素C或维生素E可以显著提高陆川猪精液冷冻保存效果。添加600 μg/mL的维生素C时，精子的存活时间可以达到113.18 h，活力可以达到42.88%。添加600 μg/mL的维生素E时，精子的存活时间可以达到120.24 h，活力可以达到42.97%。

2.2.3 维生素P

维生素P（别名芦丁）是一种水溶性维生素，它主要由柑橘属生物类黄酮、芸香素和橙皮素构成的。复合维生素C中一般都含有维生素P，也是水溶性的。刘亚伟等研究表明，维生素P的添加显著延长了猪精子低温保存时间，在第6天和第9天时，加入160 μg/mL和20 μg/mL的维生素P，猪精子的活力、活率、顶体完整率和低渗透压率都有了显著地提高。因此，在各试验组中，维生素P的最适添加浓度为160 μg/mL[8]。

2.3 卵黄

卵黄是一种起保护作用的添加剂，一般在稀释液中添加20%含量的鸡卵黄对猪精的冷冻保存有保护作用。它可以在精液冷冻-解冻时保护精液在冷热交换的环境中减少精子受到低温打击，它也被证明为是一种有效的增量剂，因为在卵黄本身的质量中发现了和精子生存环境相似的脂质。由于存在磷脂（卵磷脂）和低密度脂蛋白，它们也可以保护精子在冷冻融化过程中减少冷冲击。添加卵黄时最好是现用现配，卵黄的使用很看重环境和卫生的情况，还要考虑是否会产生有害的代谢、毒素和感染微生物病毒等风险。张美娜等[9]研究表明这些因素的产生都会影响精子的质量，会使精子的质量下降，降低精子授精的能力。韩飞等[10]在卵黄离心及精液透析预处理对猪精子冷冻效果的影响的实验中证实，卵黄进行离心处理及采用透析方法对猪精液进行实验前的冻前预处理均能明显改善精子的冷冻效果，虽然方法有明显的效果，也需不断更新完善。

2.4 褪黑素

褪黑素（Melatonin，MLT）是由动物松果体分泌的神经内分泌激素，存在于精子形成的各个阶段，也存在于动物其他的组织和细胞中[11]。在精液中加入适量的褪黑素能减轻氧化作用对精子线粒体造成的损伤，提高精子在体外存活的时间与活力。吴大平等[12]研究结果表明，采用0.4 mg/mL 维生素E+0.2 mg/mL MLT或0.2 mg/mL MLT+0.1 mM 谷胱甘肽（GSH）的组合添加剂对地中海水牛精液冷冻保存可取得较好效果。褪黑素具有极高的脂溶性和水溶性，MLT有强大的神经内分泌免疫调节活性和清除自由基抗氧化能力，可能会成为新的抗病毒治疗的方法和途径。胡靓华等[13]研究发现褪黑素适量增加（浓度为20 mg/L 为最适浓度）可以提高精液的质量，使精子的活力、顶体的完整率、质膜的完整性上都比添加维生素类时显著，同时丙二醛（malonaldehyde，MDA）降低，这说明褪黑素对精子的保存具有积极意义，能够减少 ROS 产生，并保护精子[14]。

2.5 牛磺酸

牛磺酸（Taurine，Tau）是动物体内的一种结构简单的含硫氨基酸，也是一种被广泛应用的自由氨基酸。李方方等[15]对24头年龄、体况都相同的约克夏种公猪进行对照试验，证实连续饲喂46～90 d牛磺酸可以显著提高公猪精浆SOD的活力，适宜浓度水平为6 g/kg，总体提高了精液的抗氧化能力。朱宇旌等[16]的研究证实在公猪日粮中添加N-氨甲酰谷氨酸（N-Carbamylglutamate，NCG）、Tau可以促进蛋白质合成，提高精浆抗氧化性能，从而提高精液品质。在NCG+Tau组，加白蛋白1.40%～1.66%、免疫球蛋白11.28%～12.68%、总蛋白16.35%～18.05%它们有互作效应，推荐二者共同添加。

3 抗氧化剂在猪精液保存中的应用

渗透压、理化应激和冻融温度变化等不同的因素都会影响精液质量参数，例如：生存力、膜完整性和运动性[17]。目前，牛冻精的实验是比较成熟的一类实验，在这一实验的基础上，人们开始不断尝试不同物种的冻精技术，由于猪精子“冷休克”比较严重，冷冻、解冻后精子的活力会比较低[18]，研究猪冷冻精液稀释液，更好地保存精子免受冷冻损伤，使精液冷冻的操作程序标准化，是人们为了提高人工授精效果要完成的首要任务[19]。李方舟[20]在添加苹果多酚与葡萄籽原花青素对山羊精液低温保存效果的研究中表示，山羊精液低温保存中，一定浓度组合的两种抗氧化剂苹果多酚与葡萄籽原花青素对精液的保存效果高于单独添加两种抗氧化剂效果，其中以苹果多酚与葡萄籽原花青素组合浓度为20～30 mg/L时对山羊精液低温保存效果最优。添加剂在精子的活力、存活率及运动性、顶体和膜完整性等质量参数的维持方面起着至关重要的作用。侯震坤等[21]在淫羊藿苷对关中黑猪精液常温保存效果的研究中，在使用淫羊藿苷替代部分庆大霉素添加于精液稀释剂中时，对于精液活率、活力和顶体完整性均具有一定保护作用，且能够起到抑制精液中细菌生长的作用。陈美杰等[22]研究表明在稀释液中添加40 μmol/L的迷迭香酸能达到最佳精液保存效果，显著提高了猪精子活率、质膜和顶体完整率、总抗氧化能力、SOD活性、ATP含量、线粒体膜电位和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）活性，并显著降低丙二醛含量，精子活率可达到66.47%。

4 小结与展望

随着科技不断地进步，科研人员也不断地尝试猪冷冻精液保存技术上新的突破。精液的冷冻保存可以有效地解决精液在不同的环境下保存时间的长短，也可以在疾病控制方面得到保障和国内外公猪的引进上有所提高帮助。由于冻精可以使优良基因得到无限期的保存，延长公猪的使用年限，而不受公猪死亡、损伤、采精间隔或繁殖不育的限制，有利于人为地使用高性能水平的种公猪与较多数量的母猪配种，获得更大的遗传进展。因此，精液的冷冻保存一直是人们不断尝试不断更新的一项试验。虽然冻精近几年在猪的试验上已有了巨大的突破，但是和牛、羊相比还是有较大的差距，最重要的原因就是猪的射精量大，精子对低温极其敏感，实现高效冷冻有一定的难度，希望在未来研究和发展中，猪精液的冷冻保存可以达到理想的效果。