大鳞副泥鳅、泥鳅和北方泥鳅肉质比较分析

许元峰 胡 炜

(1. 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 中国科学院种子创新研究院, 武汉 430072;2. 中国科学院大学, 北京 100049)

鱼类的肉质是一个复杂的性状, 受诸多因素的影响。评价鱼类肉质性状的指标主要有肌肉的组织学特征、鱼肉的组成成分以及生长代谢相关基因的表达特征等[1—3]。Rivero等[4]发现, 鱼肉的嫩度与肌纤维直径呈负相关, 而与肌纤维密度呈正相关, 即鱼类肌肉肌纤维越细且肌纤维密度越大, 鱼肉越细嫩。有报道表明, 鱼类脂肪含量越高, 多汁口感越强烈,风味也更佳[5]。鱼肉中的谷氨酸等呈味氨基酸、肌肽等小分子肽类、一磷酸肌苷等核苷酸衍生物可协同作用, 形成鱼肉的鲜味[6]。鱼类肌纤维的生长受到肌源性调节基因(Muscle regulatory factors,MRFs)家族的调控, 包括myod、mrf5、myog和mrf4等基因,MRFs的表达变化会改变肌肉的肉质特征[7]。

大鳞副泥鳅(P. dabryanus)、泥鳅(M. anguillicaudatus)和北方泥鳅(M. bipartitus)属均属于鳅科(Cobitidae)、花鳅亚科(Cobitinae)鱼类。其中大鳞副泥鳅和泥鳅是我国重要的养殖鱼类。大鳞副泥鳅和泥鳅的肉质研究有少量报道, 主要针对鱼肉营养成分的比较, 发现泥鳅的必需氨基酸含量、不饱和脂肪酸含量高于大鳞副泥鳅, 认为泥鳅的营养价值更高[8—12],这三种鳅较为全面的肉质比较研究报道尚未见报道。

本研究采用组织切片、生化组分分析以及实时荧光定量PCR等方法, 对大鳞副泥鳅、泥鳅和北方泥鳅的肌肉组织学特征、肌肉营养成分以及肌肉生长与脂肪代谢相关基因表达特征进行了比较分析, 以期为大鳞副泥鳅和泥鳅的遗传改良提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

大鳞副泥鳅和北方泥鳅于2018年9月采购自湖北省武汉市小东门综合市场, 泥鳅购自湖南省怀化市蔬菜公司蔬菜果品批发市场。参考《中国淡水鱼类检索》及大鳞副泥鳅和泥鳅线粒体特异性线粒体片段标记和微卫星标记, 对这三种花鳅亚科鱼类进行了种鉴别[13,14]。

1.2 样品采集

挑选外观健康、无病害症状的1—2年龄大鳞副泥鳅、2年龄及以上泥鳅和2年龄及以上北方泥鳅各30尾(其中雌雄各15尾)。大鳞副泥鳅体重(14.36±2.50) g, 体长(11.7±0.5) cm; 泥鳅体重(9.38±1.50) g, 体长(10.5±0.5) cm; 北方泥鳅体重(9.85±1.50) g, 体长(12.3±0.5) cm。

实验鱼置于水族箱禁食24h后, 放入质量浓度为180 mg/L的MS-222麻醉溶液中麻醉, 除去泥鳅皮取样。取背部及腹部肌肉共约0.5 g, 用于生化组分测定和RNA提取, 每种鳅取30个样品, 每10个样品混为一个样, 共三个平行重复。取背鳍部位躯干进行截取, 置于波恩氏液中固定24h, 随后转入75%酒精溶液中保存, 用于肌肉组织的石蜡切片, 每种鳅取30个样品。取背鳍部位躯干进行截取, 置于4%PFA/PBS溶液中4℃固定过夜, 经PBS漂洗后置于30%的蔗糖/PBS溶液中4℃脱水保存, 用于肌肉组织的冷冻切片, 每种鳅取3个样品。

1.3 肌肉组织切片

肌肉组织的石蜡切片、苏木精和伊红溶液染色以及肌肉组织的冷冻切片方法参照Xia等[15]方法。冷冻切片用0.5%油红O/(60%异丙醇+40%水)溶液染色, 使用明胶甘油封片。每种鳅制成石蜡切片15张, 冷冻切片3张。切片于显微镜下(BX-53多光谱显微成像系统, Olympus)观察, 选取肌纤维完整, 边际清晰的切片区域进行拍照。采用ImageJ软件对图片进行处理, 并测量肌纤维横截面积、周长和直径; 肌纤维密度用视场内肌纤维根数(剔除与视场右下两边有接触的个数)比上视场面积所得。

1.4 生化组分分析

每种鳅取3个混样, 进行生化组分分析。采用凯氏定氮法(GB5009.5-2016)检测样品中粗蛋白含量;采用酸水解法(GB5009.6-2016)检测样品中粗脂肪含量; 采用干燥恒重法(105±5)℃(GB/T 10362-2008)检测样品中水分含量; 采用马弗炉灼烧法(GB5009.4-2016)检测样品中灰分含量; 采用酸水解法获得样品中的氨基酸, 液相色谱仪(UItiMate 3000 UHPLC色谱仪, Thermo)检测, 根据标准品出峰时间对样品所出峰进行定性, 采用外标法进行定量, 最终测得样品中各氨基酸的含量; 采用气相色谱(CPSIL88色谱柱, Agilent)与质谱联用法(GC-MS法)检测样品中常见的37种脂肪酸酸含量, 样品经脂化、浓缩后进入GC-MS系统, 离子碎片进行自动识别和积分, 按峰面积归一化法计算样品中各脂肪酸的含量。

1.5 必需氨基酸评价

换算必需氨基酸每克氮含氨基酸的毫克数mg/g(N), 具体计算方法为将已测得的必需氨基酸的干重含量(%)除以16[16], 并将换算后的含量与鸡蛋中对应的必需氨基酸含量以及WHO/FAO于1973年提出的必需氨基酸含量进行比较[17,18]。然后根据孙海坤等[19]方法计算必需氨基酸指数(Essential amino acid index, EAAI)。

1.6 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR参照Xia等[15]方法, 每种鳅取3个混样, 每个样重复3次, 实时荧光定量PCR数据利用2–ΔΔCt法进行分析, 引物详情见表 1, 所用退火温度均为55℃。myod等肌肉生长相关基因表达水平分析时, 设大鳞副泥鳅相应基因mRNAs的表达量为对照, 其值均设为1倍;elovl5等脂肪代谢相关基因表达水平分析时, 设北方泥鳅相应基因mRNAs的表达量为对照, 其值均设为1倍。

1.7 数据处理和分析

使用Excel2010和SPSS22.0软件对实验所得数据进行统计, 含有多重复的数据均以平均值±标准误的形式表示。实验数据通过单因素方差分析(One-way ANOVA), 然后进行 Duncan’s多重比较,当P<0.05时认为差异显著。

2 结果

2.1 肌肉组织学特征

研究了三种鳅的肌肉组织学特征, 检测了肌纤维的横截面积、周长、直径以及密度, 并且观察了三种鳅肌肉中脂肪的分布情况。发现肌肉横截面积、周长和直径三项指标均是大鳞副泥鳅、泥鳅和北方泥鳅依次降低, 肌纤维密度则是大鳞副泥鳅、泥鳅和北方泥鳅依次升高(表 2)。大鳞副泥鳅肌纤维横截面积分别是泥鳅和北方泥鳅的1.28倍和1.43倍, 肌纤维密度分别是泥鳅和北方泥鳅的0.87倍和0.74倍。由此可见北方泥鳅的肌纤维最为纤细、密度最大, 泥鳅次之, 大鳞副泥鳅则是最为粗壮、密度最小(图 1)。在三种鳅中, 脂肪主要沉积于下皮组织、肌隔及腹腔内侧。其中大鳞副泥鳅背部区域肌隔中脂肪的沉积量最多, 泥鳅次之, 北方泥鳅最少; 北方泥鳅腹腔内侧有大量的脂肪沉积, 而泥鳅很少(图 2)。

2.2 肌肉营养成分

肌肉的基本组成成分 如表 3所示, 北方泥鳅的水分含量显著高于大鳞副泥鳅和泥鳅, 而大鳞副泥鳅和泥鳅的水分含量差异不显著。三种鳅的灰分含量未有显著性差异。三种鳅的粗蛋白和粗脂肪含量均存在显著性差异, 且均是大鳞副泥鳅含量高于泥鳅, 泥鳅高于北方泥鳅。

表 1 实时荧光定量PCR所用引物信息Tab. 1 Primers used for fluorescent quantitative real-time PCR

表 2 三种鳅肌纤维品质Tab. 2 Comparison on the fiber of three Cobitidaes

肌肉的氨基酸组成成分如表 4所示, 泥鳅必需氨基酸含量达(33.21±1.60)%, 显著高于大鳞副泥鳅(28.31±1.85)%和北方泥鳅(28.09±1.04)%, 大鳞副泥鳅和北方泥鳅间差异不显著。四种呈味氨基酸总含量为泥鳅最高, 大鳞副泥鳅次之, 北方泥鳅最低。

必需氨基酸营养价值将表 4中三种鳅肌肉中各必需氨基酸含量换算成每克氮所含氨基酸的毫克数, 将其与鸡蛋蛋白以及WHO/FAO 标准中的必需氨基酸含量进行比较。三种鳅必需氨基酸含量占氨基酸总量比值均达到WHO/FAO标准, 并接近鸡蛋蛋白中的比值, 三种鳅EAAI分别为: 泥鳅74.38, 大鳞副泥鳅65.11, 北方泥鳅60.14。

图 1 三种鳅肌纤维横切面Fig. 1 The cross section of these three Cobitidaes’ muscle fiber

肌肉的脂肪酸组成成分如表 5所示, 三种鳅总多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)含量无显著性差异, 但是大鳞副泥鳅除亚油酸以外的PUFA含量仅有(7.86±0.24)%, 显著低于泥鳅(24.18±1.99)%和北方泥鳅(24.43±0.26)%。大鳞副泥鳅总ω-3不饱和脂肪酸含量显著低于泥鳅和北方泥鳅, 但是其总ω-6不饱和脂肪酸显著高于泥鳅和北方泥鳅。泥鳅和北方泥鳅除少数饱和脂肪酸外, 含量无显著性差异。

2.3 肌肉生长、脂质代谢相关基因的表达

检测了myod、myog、mrf4和mstn四个肌肉生长相关基因在三种鳅肌肉中的表达差异(图 3), 大鳞副泥鳅myod、myog和mstn基因的相对表达量在三种鳅中最高, 而mrf4基因的相对表达量最低; 泥鳅mrf4基因的相对表达量在三种鳅中最高,myod和mstn基因的相对表达量介于大鳞副泥鳅和北方泥鳅之间,myog基因的相对表达量最低; 北方泥鳅myog和mrf4基因的相对表达量介于大鳞副泥鳅和北方泥鳅之间,myod和mstn基因的相对表达量三种鳅中最低。

检测了elovl5等8个脂质代谢相关基因的表达特征(图 4), 大鳞副泥鳅elovl5、fads2、scd、ucp2和lpl五个基因的相对表达量在三种鳅中最高,pparg基因的相对表达量介于泥鳅和北方泥鳅之间,fas和srebp1基因的相对表达量最低; 泥鳅srebp1基因的相对表达量在三种鳅中最高,fas基因的相对表达量介于大鳞副泥鳅和北方泥鳅之间,elovl5、fads2、scd、lpl和pparg五个基因的相对表达量最低; 北方泥鳅fas和pparg基因的相对表达量在三种鳅中最高,elovl5、fads2、scd、和srebp1五个基因的相对表达量介于大鳞副泥鳅和泥鳅之间; 泥鳅和北方泥鳅ucp2基因的相对表达量差异不显著。

3 讨论

3.1 三种鳅的肉质特点

鱼肉的嫩度一直是养殖鱼类品质性状重要的口感指标之一。鱼类肌肉的嫩度与肌肉组织中肌纤维的特征密切相关, 一般认为肌纤维直径越小而肌纤维密度越大, 鱼肉的细嫩度越佳, 口感越好[6]。按照上述标准, 北方泥鳅肉质最为细嫩, 泥鳅次之,大鳞副泥鳅肉质相对粗糙。

油润多汁也是评价鱼肉肉质的一项重要指标,肉类多汁的口感与肌肉中粗脂肪的含量呈现正相关[20], 大鳞副泥鳅的粗脂肪含量最高, 而且大鳞副泥鳅脂肪在背部、皮下组织以及腹腔内侧分布广泛,因此在三种鳅中, 大鳞副泥鳅的肉质最为油润多汁。

鱼肉的鲜味是不同于其他肉类的一项重要口感指标, 也是影响鱼肉价格的关键因素之一。呈味氨基酸的组成以及含量, 特别是呈鲜味的谷氨酸和天冬氨酸含量是影响鱼肉鲜味的重要因素[18]。比较三种鳅的总呈味氨基酸含量以及谷氨酸和天冬氨酸含量, 认为泥鳅肉质最为鲜美, 大鳞副泥鳅次之, 北方泥鳅鲜味程度较差。

3.2 三种鳅的营养价值特点

图 2 三种鳅肌肉中脂肪分布Fig. 2 Lipid distribution in muscle of three Cobitidaes

表 3 三种鳅肌肉的基本营养成分Tab. 3 Basic muscle nutrient components of three Cobitidaes muscle (%; n=3)

表 4 三种鳅肌肉中氨基酸组成Tab. 4 Muscle amino acid composition of three Cobitidaes (%;n=3)

鱼肉的营养价值主要决定于各种营养物质的含量和组成成分。必需氨基酸是人体内无法合成或者合成量较少无法满足人体新陈代谢需要的一类氨基酸, 必需氨基酸摄入不足会造成机体代谢紊乱、抵抗能力降低等问题[21]。通过计算肉类的EAAI可以客观地反映肉类中必需氨基酸的营养价值。脂肪酸根据饱和程度可分为饱和脂肪酸(Saturated fatty acid, SFA)、单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid, MUFA)及多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid, PUFA)三类[22]。PUFA根据双键出现的位置分为ω-6不饱和脂肪酸和ω-3不饱和脂肪酸, 两者的比例影响PUFA降血脂功能, 目前普遍认为SFA含量低, PUFA含量特别是ω-3不饱和脂肪酸高的脂肪酸摄入结构更为健康。此外, 花生四烯酸、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)对于幼儿发育、抗癌及预防心血管疾病有特殊作用, 三者的含量也在一定程度上反映了鱼肉的营养价值[23]。

表 5 三种鳅肌肉中脂肪酸组成Tab. 5 Muscle fatty acid composition of three Cobitidaes (%,n=3)

图 3 三种鳅肌肉组织中肌肉生长相关基因相对表达量的比较(同一组上标不同表示差异显著, P<0.05)Fig. 3 The relative expression levels of muscle growth-related genes in three Cobitidaes’ muscular tissue (the different superscripts represents significant difference in the same group, P<0.05)

图 4 三种鳅肌肉组织中脂肪代谢相关基因相对表达量的比较(同一组上标不同表示差异显著, P<0.05)Fig. 4 The relative expression levels of lipid metabolism-related genes in three Cobitidaes’ muscular tissue (the different superscripts represents significant difference in the same group, P<0.05)

三种鳅均有必需氨基酸含量高以及PUFA含量高的特点。在三种鳅必需氨基酸评价比较中, 泥鳅、大鳞副泥鳅和北方泥鳅的EAAI依次降低。三种鳅总PUFA含量无显著性差异, 但是在除去亚油酸的总PUFA含量比较中, 大鳞副泥鳅远低于泥鳅和北方泥鳅, 大鳞副泥鳅中各PUFA的含量不如泥鳅和北方泥鳅均衡。此外, 大鳞副泥鳅ω-3不饱和脂肪酸含量仅为泥鳅的52.83%和北方泥鳅的53.75%,花生四烯酸、EPA和DHA的含量均低于泥鳅和北方泥鳅。综上, 在氨基酸方面的营养价值, 泥鳅要高于大鳞副泥鳅, 大鳞副泥鳅高于北方泥鳅; 在脂肪酸方面的营养价值, 泥鳅和北方泥鳅差异不明显,而大鳞副泥鳅低于泥鳅和北方泥鳅。

3.3 三种鳅肌肉生长与脂质代谢相关基因表达特点

动物肌肉生长受myod、myog、mrf4和mstn等基因调控。myod基因是肌细胞生成的决定基因,myog和mrf4则是在肌细胞的分化过程中发挥功能。在肌肉生长过程中,myod最先表达, 随后诱导myog表达, 而mrf4作为终端诱导因子基因最后表达[24—28]。mstn是肌肉生长过程中的负调控基因, 抑制肌肉的过快生长[29]。

大鳞副泥鳅的肌纤维横截面积最大、粗蛋白含量最高, 表明大鳞副泥鳅肌肉比泥鳅和北方泥鳅发达; 此外, 大鳞副泥鳅myod的相对表达量较高,mrf4的相对表达量较低, 且大鳞副泥鳅mstn的相对表达量较高, 提示大鳞副泥鳅的肌细胞处于肌肉生长过程的早期阶段, 而且肌肉有进一步生长的潜力。北方泥鳅肌肉生长相关基因的表达特点与大鳞副泥鳅相反,myod的相对表达量较低,mrf4的相对表达量较高,mstn的相对表达量很低; 而且北方泥鳅肌纤维横截面积最小、粗蛋白含量低, 提示北方泥鳅更多的肌细胞处于肌肉生长过程的后期阶段, 肌肉不如大鳞副泥鳅和泥鳅发达。泥鳅的肌肉生长情况则处于大鳞副泥鳅和北方泥鳅之间。

elovl5、lpl、fas、pparg和srebp1为调节脂肪形成的基因, 其编码的酶通过催化延长脂肪酸链、水解甘油三脂释放游离脂肪酸、合成脂肪酸、合成三酰甘油等方式促进脂肪的形成[30—35]。ucp2为调节脂肪分解的基因, 其编码的酶可增加三羧酸循环的活性和脂肪酸的氧化, 促进脂肪分解[36]。fads2和scd为调节不饱和脂肪酸形成的基因, 相应的酶催化脂肪酸不饱和键的形成[33]。

大鳞副泥鳅粗脂肪含量和总不饱和脂肪酸含量最高; 同时大鳞副泥鳅elovl5、lpl、ucp2、fads2和scd五个基因在三种鳅中表达量最高, 提示在三种鳅中, 大鳞副泥鳅的脂肪代谢活动最为活跃。北方泥鳅elovl5、lpl、fas、pparg、fads2和scd六个基因的表达量均显著高于泥鳅,ucp2的表达量两者间无显著性差异; 而且北方泥鳅腹腔内侧的内脏脂肪沉积量根据组织学切片分析远高于泥鳅, 提示北方泥鳅脂肪形成能力、不饱和脂肪酸转化能力和内脏脂肪沉积能力强于泥鳅, 北方泥鳅的脂肪代谢活动相较于泥鳅更为活跃。但在肌肉生化组分检测中, 泥鳅粗脂肪含量高于北方泥鳅, 可能的原因是在以肌肉作为样品检测粗脂肪含量时, 内脏脂肪大部分并未被检测所致。

4 结论

综上所述, 三种鳅肉质各有特点。大鳞副泥鳅蛋白质含量高、油润多汁, 但是肉质相对粗糙、营养价值较差; 泥鳅营养价值极高且肉质鲜美; 北方泥鳅肉质细嫩, 脂肪酸组成方面的营养价值高, 但是肉质的鲜美程度较差。三种鳅的肌肉生长活动和脂肪代谢活动存在差异, 可能是上述三种鳅肉质各具特点的原因之一。进一步解析上述三种鳅的肉质形成的分子遗传基础, 对于鳅科鱼类新品种研制具有重要的意义。