微波辅助法提取火龙果果皮色素及其功能活性研究

胡元庆,王建荟,李凤霞

(闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州 363000)

颜色是食品质量的重要属性[1]。食品工业中使用着色剂的目的包括:恢复加工过程中丢失的颜色、增强物质的色彩、最小化批次之间的颜色差异、对无色食品进行着色[1-2]。近年来,用天然染料替代化学合成着色剂是一个明显的趋势[1,3]。其原因主要有以下三方面:人造染料可能对健康有不利影响[4];天然色素可以作为食品成分而不是食品制备中的添加剂[5];摄入天然色素对人类健康有益[6]。然而,天然染料通常不稳定,易受温度、光线、氧气、pH、水活度等因素影响[7]。但合成色素因含有砷、铅、铜、苯酚等,表现慢性毒性和致癌作用,天然色素则具有较高的安全性[8]。我国消费者以生食火龙果果肉为主,而占其重量三分之一的果皮常被作为废料舍弃,不但造成了环境污染,也浪费了大量的天然资源[9]。从火龙果果皮中提取色素,可以拓宽色素的来源渠道,满足轻工业对天然色素日渐增长的需求,提高火龙果产品的附加值[10-11]。

火龙果(Hylocereusundatus)不但具有丰富的营养价值,其药用价值和保健价值也很突出[12]。从果皮到果肉富含天然色素,其中果皮色素约占整果色素总量的21%,颜色呈玫瑰红或紫红色[13]。火龙果色素组成稳定,色域范围广,具有抑菌[14]、抗氧化[11]、降血脂[15]等功效,且无明显的急性毒性和致突变性,是优良的天然植物来源染色剂[13,16]。色素主要成分为甜菜苷,是一种极性或弱极性的水溶性有机物,也可溶于甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂[17]。

甜菜苷是一种水溶性含氮色素,与其它植物色素相比研究较少[14,18]。由于具有出色的着色力,甜菜苷被用作食品着色剂,且具有其他药理特性,如抗癌和抗血脂活性[18-19]。色素提取工艺主要有化学溶剂法、冷冻压榨法、CO2萃取法和超声波提取法等[20]。李昌辉等[21]最早以溶剂浸提法为对照,探讨了微波辅助萃取火龙果果皮色素的方法,结果表明微波法提取效果明显优于常规浸提法。陈艳红等[22]以火龙果果皮干粉为原料,研究了微波法提取色素的工艺,证明微波辅助法明显优于浸提法。王娅玲等[23]通过单因素和正交实验研究了微波辅助法提取火龙果果肉色素的提取工艺,比浸提法用时更短,效率更高。此外,很多学者也探索了超声波辅助提取火龙果果皮色素的工艺条件[13,20,24-27]。李玲等[27]通过响应面法优化了超声波辅助提取果皮色素的最佳工艺,含量可达159.14 mg/100 g。岳鹍等[13]2015年也优化了超声波提取火龙果果皮色素的工艺,比浸提法具有耗时短、溶剂用量少和提取效率高的优势。超声辅助法提取所需时间大约15～25 min[13,25],而微波辅助法仅需60～80 s[22-23],微波法较省时;微波辐照可提高红甜菜中甜菜苷的提取效率,且在第一次辐照后的短时间冷却会延迟第二次辐照中的甜菜苷降解[28],微波法能减少色素的降解损耗;采用微波辅助技术有助于提高甜菜苷的抗氧化功能[29-30]。基于以上三方面,本文拟系统优化微波辅助法提取火龙果皮色素的工艺,研究色素生物学功能,对食品工业中天然色素的开发利用具有重要的意义。

本实验优化了微波辅助提取火龙果果皮色素的工艺条件,获得提取液后真空冷冻干燥得到色素干粉,然后分析色素的抑菌性和抗氧化活性,为火龙果果皮的开发与应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红皮白肉火龙果 购于漳州市新华都超市;志贺氏菌B4、大肠杆菌D5、蜡状芽孢杆菌63302、金黄色葡萄球菌CMCC26003、副溶血弧菌ATCC17802 由漳州海关综合技术服务中心微生物检测室惠赠,在生物科学与技术学院实验室保存备用;三(羟甲基)氨基甲烷(Tris) 国药集团化学试剂有限公司;营养琼脂、肉汤培养基、TCBS琼脂 北京陆桥技术有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、甜菜苷标准品(HPLC≥98%) 上海源叶生物科技有限公司;七水合硫酸亚铁、氯化钠、抗坏血酸、焦性没食子酸、水杨酸、无水乙醇、盐酸、30%过氧化氢 西陇科学股份有限公司。

DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限公司;M1-235A美的微波炉 广东美的厨房电器制造有限公司;MIKRO 220R高速冷冻离心机 德国Hettich公司;UV-1750岛津紫外可见分光光度计 厦门精艺兴业科技有限公司;UV-1100紫外可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司:LG 0.2真空冷冻干燥机 沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司;BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;GSP-9050MBE隔水式恒温培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-1FD超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将火龙果果皮洗净去蒂,去除果皮上绿色的部位,用剪刀剪成小块置于洁净的培养皿中,60 ℃烘干,然后破碎成粉,过80目筛,低温条件下避光保存。

1.2.2 最大吸收波长的测定 本实验选取30%乙醇、50%乙醇和去离子水3种溶剂为提取剂,测定火龙果果皮色素的最大吸收波长,用甜菜苷标准品的最大吸收波长作参照。称取3份火龙果果皮粉各0.5 g于三角瓶中,按1∶60 (g/mL)的料液比分别加入30%乙醇、50%乙醇和去离子水,在440 W的微波功率下提取60 s,提取液于4000 r/min离心15 min,取上清液2.5 mL至10 mL棕色容量瓶中定容(甜菜苷标准品的操作方法同上),得到色素待测液。待测液用分光光度计进行400～700 nm可见光区全波段扫描,确定最大吸收波长(λmax)。

1.2.3 甜菜苷标准曲线的绘制 称取甜菜苷标准品5 g于100 mL容量瓶中用20%乙醇定容,再吸取1 mL该溶液于50 mL容量瓶中,得到1 mg/mL的甜菜苷标准溶液。用移液枪依次取标准溶液0、2、4、6、8、10 mL分别于6个10 mL容量瓶中并定容。在λmax处分别测定各溶液吸光度。以吸光度(A)为纵坐标,甜菜苷浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线,得出回归方程。

1.2.4 火龙果果皮色素提取的单因素实验设计 设定初始提取条件为:料液比1∶60 (g/mL)、乙醇浓度30%、微波功率440 W和微波时间60 s。称取果皮粉0.5 g于三角瓶中,按不同料液比(g/mL)(1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80)、不同乙醇浓度(10%、20%、30%、40%、50%)、不同微波功率(136、264、440、616、800 W)和不同微波时间(20、40、60、80、100 s)进行提取,考查某一因素时其它因素按照以上初始条件操作。提取液于4000 r/min离心15 min,取上清液2.5 mL于10 mL棕色容量瓶中定容,得到色素待测液。待测液在λmax处测定吸光度,计算甜菜苷含量,以甜菜苷含量选取各因素最佳条件,每个样品平行测定3次,取平均值,结果在α=0.05下进行显著性分析。

1.2.5 火龙果果皮色素提取的正交实验设计 在上述单因素实验的基础上,选取料液比、乙醇浓度、微波功率和微波时间4个因素作为自变量,用建立的回归方程计算火龙果果皮的甜菜苷含量(mg/mL)为评价指标,采用极差法,进行四因素三水平L9(34)的正交实验(见表1)。

表1 正交实验因素与水平表

1.2.6 最优工艺验证实验 为保证所得最优工艺的可靠性,进行验证实验。称取果皮粉0.5 g于三角瓶中,按照最优工艺制备色素提取液,操作同上述1.2.4,并在λmax处测定色素溶液的吸光度,样品平行测定5次取平均值,用建立的甜菜苷浓度与吸光度的回归方程计算提取液色素浓度,然后按照式(1)计算色素得率。

式(1)

式中:C：提取液中色素浓度(g/mL);V:色素溶液定容后体积(mL);m:果皮粉末质量(g)。

1.2.7 火龙果果皮色素冻干粉制备 称取过筛好的25 g火龙果果皮粉,用最佳提取工艺制备提取液,4000 r/min离心15 min,将上清液均匀倒于洁净的培养皿中,冰箱冷冻层处理1 d,然后在真空度100 Pa、温度-30 ℃条件下真空冷冻干燥2.5 d,得到火龙果果皮色素干粉成品,称重。

1.2.8 火龙果果皮色素抑菌活性研究

1.2.8.1 纸片法检测抑菌圈 待测菌种于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,从斜面培养基挑取菌种于装有玻璃珠的30 mL无菌生理盐水中,振荡10 min,制成菌悬液。调整菌悬液的浓度为106～107CFU/mL,冷藏备用。将灭菌的6 mm滤纸片分别浸泡于无菌生理盐水和火龙果果皮色素提取物溶液中,避光放置过夜。然后在无菌操作台上风干备用。用移液枪吸取200 μL菌悬液至固体培养基上涂布均匀。无菌操作将色素纸片贴于培养基上,轻压使其完全接触,每个菌种做3个平行。在37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h,测量抑菌圈直径。

1.2.8.2 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定 以浓度梯度为10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的火龙果果皮色素提取液分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌进行MIC和MBC测定,另以50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL的浓度梯度对志贺氏菌和蜡状芽孢杆菌做MIC和MBC测定。向灭菌试管中加入5 mL肉汤培养基,0.05 mL待测菌悬液(106～107CFU/mL)和0.2 mL提取液,空白管加无菌水,每个浓度做3次平行,于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,以试管中无菌生长的最低浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。从无细菌生长的试管吸取0.2 mL样液滴入平板培养基中,涂布均匀,37 ℃倒置培养24 h,以色素浓度最低且平板上无细菌生长试管所对应的浓度为最低杀菌浓度(MBC)[9]。

1.2.9 火龙果果皮色素抗氧化活性研究

1.2.9.1 火龙果果皮色素对·OH清除率的测定 取11支洁净试管,向其中5支试管依次加入9 mmoL/L FeSO4溶液1 mL,9 mmoL/L水杨酸-乙醇溶液1 mL,不同质量浓度的火龙果果皮色素溶液1 mL,再加入8.8 mmoL/L的H2O2溶液1 mL启动反应;另5支试管中除用1 mL蒸馏水代替上述H2O2溶液外,其他试剂均进行相同操作;剩余1支试管则用1 mL蒸馏水代替色素溶液,其余操作相同。反应启动后,振荡摇匀,于37 ℃水浴锅中温育30 min,冷却。以蒸馏水作参比,紫外可见分光光度计在510 nm下测定吸光度,并按照式(2)求出火龙果果皮色素对·OH清除率,同时以等浓度的VC溶液做阳性对照,具体操作与色素溶液相同。

式(2)

式中:A0:以水代替色素溶液所测得的吸光度;A1:色素溶液与H2O2反应后所测得的吸光度;A2:以水代替H2O2溶液所测得的吸光度。

式(3)

式中:A0:以水代替色素溶液所测得的吸光度;A1:色素溶液与邻苯三酚反应后所测得的吸光度;A2:以水代替邻苯三酚溶液所测得的吸光度。

1.2.9.3 火龙果果皮色素对DPPH·清除率的测定 取5支洁净试管,向其中依次加入0.02 mg/mL的DPPH溶液(用无水乙醇配制)2 mL,不同质量浓度的色素溶液2 mL,室温避光反应30 min[32];另取5支试管以无水乙醇代替DPPH溶液进行同样的操作,再取1支试管以无水乙醇代替色素溶液进行相同操作。于波长517 nm处的测定吸光度,按照式(4)求火龙果果皮色素对DPPH·的清除率,同时以等浓度的VC溶液做阳性对照,具体操作与色素溶液相同。

式(4)

式中:A0:以无水乙醇代替色素溶液所测得的吸光度;A1:色素溶液与DPPH反应后所测得的吸光度;A2:以无水乙醇代替DPPH溶液所测得的吸光度。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 火龙果果皮色素的最大吸收波长

分别以30%乙醇溶液、50%乙醇溶液和去离子水为提取剂,在400～700 nm可见光谱区扫描火龙果果皮色素3条吸收光谱曲线(见图1),均在同一波长(534 nm)出现最高峰,而甜菜苷标准品在534、535和536 nm处都有最大吸光度,吸光度均为0.3895,所以本实验以534 nm作为火龙果果皮色素的最大吸收波长(λmax),此结果与李昌辉等[21]、陈艳红等[22]的火龙果果皮色素最大吸收波长535 nm的结果相近。在此波长下,生成甜菜苷的标准曲线,得到回归方程y=0.9121x-0.0009(R2=0.9968)。

图1 不同提取剂的火龙果果皮色素的吸收光谱

2.2 火龙果果皮色素提取的单因素实验结果与分析

2.2.1 料液比对火龙果果皮色素提取的影响 由图2可知,料液比为1∶50 (g/mL)时,提取液的甜菜苷含量最大。这是因为随着料液比的增加,提取剂的体积也逐渐增加,但固定时间内440 W微波功率下加热所产生的热量不足以使色素充分溶出[23],色素的吸光度逐渐降低,甜菜苷含量也逐渐降低。另外,随着料液比增加,甜菜苷分子间作用力减弱,分子稳定性降低而被分解[27],导致提取率下降。因此,最佳料液比为1∶50 (g/mL)。

图2 料液比对火龙果果皮色素提取的影响

2.2.2 乙醇浓度对火龙果果皮色素提取的影响 由图3可见,随着乙醇浓度的升高,色素中甜菜苷含量也逐渐升高,当乙醇浓度超过20%时,甜菜苷含量随着乙醇浓度的升高反而下降。这是因为火龙果果皮中的色素是一种亲水性物质,当乙醇浓度增大时,水的比例就会减小,色素无法充分溶出,反而使果皮中的醇溶性或脂溶性成分溶出,导致火龙果果皮色素提取液的吸光度降低,甜菜苷含量减少[22-23]。另外,乙醇浓度过高在一定程度上会使甜菜苷变性,或者抑制色素的提取[27]。因此,乙醇的最佳提取浓度为20%。

图3 乙醇浓度对火龙果果皮色素提取的影响

2.2.3 微波功率对火龙果果皮色素提取的影响 由图4可知,随着微波功率的增大,甜菜苷含量也渐增大,当功率为440 W时达到最高值,之后则逐渐降低。这是因为随着微波功率的增加,分子的运动逐渐加快,分子之间发生碰撞和摩擦的频率也逐渐增大,反应产生的热效应增加[33],加速了色素的溶出,但当功率达到一定程度后,产生的热效应就会破坏色素分子的结构,致使其分解[28],从而导致色素溶液的吸光度降低,甜菜苷含量减少。另外,功率越高果胶被过多提取,使红色素损失增加[22]。因此,选择微波功率440 W作为最佳提取条件。

图4 微波功率对火龙果果皮色素提取的影响

2.2.4 微波时间对火龙果果皮色素提取的影响 由图5可知,当微波处理时间为60 s时,甜菜苷含量最大。这是因为随着提取时间的增加,色素与提取剂充分接触、溶出,提取液中色素含量逐渐增加[28],吸光度也逐渐升高。当提取时间过长时,就会发生溶剂挥发,并随时间的增加而增强,溶出的色素就会减少,且长时间的微波辐射会改变色素的结构,使色素的稳定性降低,从而导致火龙果果皮色素提取液的甜菜苷含量降低[23]。另外,微波作用时间越长,提取溶液体系产热越多,过高的温度使甜菜苷分子分解[27]。因此,最佳微波处理时间为60 s。

图5 微波处理时间对火龙果果皮色素提取的影响

2.3 火龙果果皮色素提取的正交因素实验结果

在上述单因素实验基础上,选取3个水平,以提取液的甜菜苷含量为考查指标,进行L9(34)正交实验,结果见表2。

表2 火龙果果皮色素提取正交实验结果

由表2和表3可知:极差RB>RA>RD>RC,所以各因素对微波提取火龙果果皮色素的影响程度依次为:B(乙醇浓度)>A(料液比)>D(微波时间)>C(微波功率),且料液比、乙醇浓度、微波功率和微波时间影响都显著,为重要的提取条件。从k值可知,最优工艺组合为A2B2C2D2。

表3 正交实验结果的方差分析

2.4 最佳工艺验证及得率

按照以上最佳工艺条件提取火龙果果皮色素溶液,其吸光度的平均值为0.590,依据回归方程计算得溶液浓度为0.537 mg/mL,按照式(1)计算色素得率为1.074%,略高于张灵帮等[24]的结果。验证实验结果证明微波辅助火龙果果皮色素的最佳工艺为:乙醇浓度20%、料液比1∶50 (g/mL)、微波时间60 s、微波功率440 W。采用最佳工艺制得色素溶液,冻干得到成品粉末,从25 g火龙果果皮粉中共得到263 mg甜菜苷色素干粉,与得率公式基本吻合。干粉避光低温保存备用。

2.5 火龙果果皮色素抑菌实验

2.5.1 抑菌圈直径 由表4可知,火龙果果皮色素提取物对5种测试菌种均显示抑制作用,其中对大肠杆菌的抑制效果最好,其次为金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、志贺氏菌和蜡状芽孢杆菌,在李霞等[34]和熊建文等[35]对火龙果果皮抑菌活性的研究中也发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌等菌种有抑制作用。

表4 火龙果果皮色素对测试菌的抑菌圈直径

2.5.2 火龙果果皮色素的 MIC和MBC结果 在10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL浓度时,火龙果果皮色素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌皆有明显的抑菌效果,与Yong等[17,36]的研究结果一致。但志贺氏菌和蜡状芽孢杆菌的试管均出现浑浊,将浓度增加至50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL后,测得其对志贺氏菌和蜡状芽孢杆菌的MIC值分别为12.5和25 mg/mL,MBC值均为25 mg/mL。说明在上述第一个浓度范围内,火龙果果皮色素对志贺氏菌和蜡状芽孢杆菌无抑菌效果,将浓度增大后,则表现出明显的抑菌效果。

表5 火龙果果皮色素对测试菌的MIC和MBC测定

2.6 火龙果果皮色素抗氧化结果与分析

2.6.1 火龙果果皮色素对·OH的清除结果 由图6可知,随着火龙果果皮色素提取物浓度的增加,·OH清除率的曲线呈上升趋势,色素浓度与·OH清除率呈正相关,关系式为y=10.022x+6.298(R2=0.9874)。说明火龙果果皮色素对羟自由基有清除效果,但清除能力略低于VC,在本实验测定的浓度范围内,色素对·OH的清除率最高可达到56.2%。

图6 火龙果果皮色素对·OH的清除结果

图7 火龙果果皮色素对的清除结果

2.6.3 火龙果果皮色素对DPPH·的清除结果 由图8可知,同一浓度下火龙果果皮色素对DPPH·的清除能力略低于VC,但随着浓度的增加而增强。在色素浓度为6 mg/mL时对DPPH·的清除率可超过50%,10 mg/mL时清除率达到83.64%,与VC相差7%,色素与清除率的关系式为y=14.517x+12.35(R2=0.9948),说明火龙果果皮色素对DPPH·有很好的清除效果。本结果与Gengatharan等[9]对酸奶中添加火龙果色素清除DPPH·的效果一致。

图8 火龙果果皮色素对DPPH·的清除结果

3 结论

本研究以火龙果果皮为研究对象,采取微波萃取的方法对其中的色素进行提取,并研究该色素的抑菌活性和抗氧化活性。在单因素实验的基础上,采用正交实验设计对火龙果果皮色素的提取工艺进行优化,并对最优条件进行了验证,得到最佳工艺为:乙醇浓度20%、料液比1∶50 (g/mL)、微波时间60 s、微波功率440 W。将该条件下得到的色素提取物经冷冻干燥,进行抑菌和抗氧化实验,结果表明火龙果果皮色素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、志贺氏菌和蜡状芽孢杆菌都有抑制效果,对大肠杆菌的抑制效果最为明显,其最低抑菌浓度为1.25 mg/mL,最低杀菌浓度为2.5 mg/mL;抗氧化实验中,色素对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH·均具有较明显的清除效果,其中对超氧阴离子自由基的清除效果与VC相当,说明火龙果果皮色素具有抑菌和抗氧化活性。本研究为解决火龙果果皮利用率低的问题提供了依据,采取精细分离提取技术,可将火龙果果皮作为制备天然抑菌剂和抗氧化剂的原料来源。