响应面法优化野金柴总黄酮超声辅助提取工艺及其不同组分抗氧化能力研究

李洪安,李夏嘉龙,邓泽元,江和栋,李红艳

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

野金柴,是壳斗科栎属植物多穗石柯(LithocarpuspolystachyusRehd)的干燥叶[1],又名多穗柯。广泛分布于长江南部,尤以江西、福建、湖南、广西等省最为广泛[2]。野金柴中富含黄酮类化合物[3],其中,根皮苷具有强烈的甜味,甜度可达蔗糖的300倍[4],一般应用于生产茶饮料,根皮苷有较高的抗氧化能力[5],在食品生产中有较高的利用价值。金弘昕等[6]对野金柴的化学组分进行了分离鉴定,研究表明,野金柴黄酮类物质除根皮苷外,还有槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、3-羟基根皮苷、山柰酚3-O-α-L-鼠李糖苷几种黄酮化合物,未对其活性进行进一步研究;单思聪等[7]的研究表明,多穗柯总黄酮具有较好的抗氧化能力,陈阳[8]的研究证实多穗柯根皮苷具有一定的抗氧化作用。但目前除根皮苷外,尚未见关于野金柴中其他黄酮类化合物研究利用的报道。

目前,对于野金柴中黄酮类化合物的提取,大多采用加热回流、长时间浸提等方法,但此类方法存在提取时间长、效果不佳、消耗溶剂量大等缺点,提取时的高温还可能破坏野金柴中的功能性成分。相比之下,超声辅助提取具有高效、消耗溶剂量小、绿色环保等优点[9]。超声波在液体介质中能产生空化效应,能有效地破坏包埋结构的外层,加速功能成分的溶出,从而提高提取效率。在超声提取过程中,液料比、乙醇浓度、功率、超声时间等因素对得率有较大的影响。

本文以野金柴为原料,采用响应面法优化野金柴总黄酮的超声辅助提取工艺,并用ADS-7大孔树脂分离总黄酮中的根皮苷,进而对比总黄酮、根皮苷、黄酮R(除去根皮苷后的剩余黄酮组分)的抗氧化能力,为野金柴中黄酮类化合物的综合利用提供基础数据,提高野金柴的生产利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野金柴 壳斗科栎属植物多穗石柯(LithocarpuspolystachyusRehd)的干燥叶,江西叶苷清生物科技有限公司提供;芦丁(生化试剂≥98%)、1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、VC和Trolox 阿拉丁化学试剂有限公司生产;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、过硫酸钾 分析纯,天津大贸公司;盐酸、无水乙醇 分析纯,西陇科学公司。

DGG-9140A电热鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;AR323CN电子天平 奥豪斯仪器有限公司;TDL-5-A飞鸽牌台式离心机、FW80高速万能粉碎机 上海安亭科学仪器厂;GA92-IID超声波粉碎机 无锡市上佳生物技术有限公司;722G可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;ELx800光吸收酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;EZ-L100-P200中压制备系统 利穗科技(苏州)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 野金柴预处理 将野金柴样品放入恒温干燥箱内60 ℃烘干至恒重,粉碎,过60目筛,收集粉末,密封,低温保存。

1.2.2 野金柴总黄酮提取 精确称取适量野金柴粉末,加一定浓度乙醇溶液混合均匀,静置10 min,按照设定好的条件,进行超声波辅助提取,提取液4200 r/min离心6 min,离心后取上清液待测。

1.2.3 野金柴中总黄酮的测定

1.2.3.1 绘制芦丁标准曲线 精密称取12.5 mg芦丁标准品于25 mL容量瓶中,用75%乙醇定容,即得0.5 mg/mL的芦丁标准溶液,精确移取标准溶液0、0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、1.75 mL于10 mL容量瓶中,分别加入5% NaNO2溶液0.4 mL,摇匀静置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL,摇匀静置6 min,加4% NaOH溶液4 mL,加无水乙醇定容,摇匀静置10 min,按照分光光度法,在510 nm处测吸光度A[10],以吸光度A为纵坐标,芦丁质量浓度C为横坐标绘制标准曲线。得到标准曲线方程为A=13.04435C-0.00287,R2=0.9996。

1.2.3.2 黄酮得率计算 精密吸取野金柴黄酮提取液0.5 mL于10 mL容量瓶中,按上述方法测定样品中总黄酮含量。按照以下公式计算得率(F):

式中:C为由回归方程计算出黄酮的浓度,mg/mL;N-稀释倍数;V-提取液体积,mL;M-称取的野金柴粉末质量,g。

1.2.4 野金柴总黄酮提取单因素实验 高温易改变黄酮类物质活性,且不利于调控,因此固定提取温度30 ℃,同时其余因素不变,考察乙醇浓度、液料比、功率、超声时间等单因素对野金柴总黄酮得率的影响,每组实验重复三次。

1.2.4.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响 在液料比30∶1、功率500 W、超声时间30 min的条件下,分别考察乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%对野金柴黄酮得率的影响。

1.2.4.2 液料比对黄酮得率的影响 在乙醇浓度70%、功率500 W、超声时间30 min的条件下,分别考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1对野金柴黄酮得率的影响。

1.2.4.3 超声功率对黄酮得率的影响 在乙醇浓度70%、液料比30∶1、超声时间30 min的条件下,分别考察功率300、400、500、600、700 W对野金柴黄酮得率的影响。

1.2.4.4 超声时间对黄酮得率的影响 在乙醇浓度70%、液料比30∶1、功率500 W的条件下,分别考察提取时间20、30、40、50、60 min对野金柴黄酮得率的影响。

1.2.5 响应面优化试验 根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理,基于单因素实验结果,以液料比(A)、乙醇浓度(B)、超声功率(C)、超声时间(D)为响应因素,编码水平为-1、0、1,野金柴黄酮得率(F)为响应值,采用四因素三水平的响应面分析法进行实验设计[11],因素水平设计见表1。

表1 响应曲面试验因素水平设计

1.2.6 大孔树脂法分离总黄酮中的根皮苷

1.2.6.1 大孔树脂的预处理 按李斌等[12]的方法对大孔树脂进行预处理。

1.2.6.2 吸附与洗脱 用野金柴总黄酮提取液对预处理好的大孔树脂进行浸泡,并采用常规湿法装柱,使其自然沉降不留气泡,并静态吸附10 h。采用EZ Purifier中压制备系统进行自动吸附洗脱,同时配备紫外分光光度检测器进行自动检测分离。以3 BV的流速进行上样动态吸附0.5 h,共计上样500 mL。之后使用70%乙醇溶液以2 BV的流速进行洗脱1 h,并设定在紫外吸收285 nm处收集根皮苷溶液[13];之后再用75%、85%、95%乙醇溶液以2 BV的流速各洗脱0.5 h,将树脂内剩余吸附物质全部洗出。70%乙醇洗脱2 BV可将大多数根皮苷洗下,之后的递增梯度洗脱可将剩余黄酮物质洗脱[14]。洗脱液进入紫外分光光度检测器中,设定根皮苷收集波长为285 nm[15],收集阈值300 mAU,自动收集器采用多管收集的方式将洗脱液收集,在285 nm下无吸收的其他组分则流入回收装置,完成对根皮苷与黄酮R的分离。参考金弘昕等[6]的结论,野金柴黄酮类物质除根皮苷外,还含有槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮苷、3-羟基根皮苷、山柰酚3-O-α-L-鼠李糖苷,故黄酮R即为上述黄酮物质的多组分溶液。

1.2.6.3 浓缩与收集 将纯化的根皮苷溶液、总黄酮溶液、黄酮R溶液分别经旋蒸浓缩,氮吹后收集。

1.2.7 抗氧化活性研究

1.2.7.1 DPPH自由基清除率的测定 以维生素C(10、15、20、25、30、35、40 mg/mL)作为阳性对照,分别检测10、15、20、25、30、35、40 mg/mL浓度的野金柴黄酮提取液、黄酮R溶液、纯化根皮苷溶液对0.2 mmol/L DPPH溶液的自由基清除率。分别测定VC和三种溶液对DPPH自由基的清除率,清除率越高表明清除自由基的能力越强,即抗氧化能力越强。精密吸取100 μL的野金柴黄酮提取液、黄酮R溶液、根皮苷溶液,分别加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,37 ℃避光静置30 min,在517 nm下用酶标仪测定其吸光值A样品,以乙醇为空白,在517 nm下用酶标仪测定吸光值A空白[16]。按下式计算自由基清除率,且以清除率为纵坐标,溶液浓度为横坐标绘图,维生素C作为阳性对照,实验重复三次,取平均值和SD值:

1.2.7.2 清除ABTS自由基活性的测定 分别检测10、15、20、25、30、35、40 mg/mL浓度的野金柴黄酮提取液、黄酮R溶液、纯化根皮苷溶液对ABTS溶液的自由基清除率。用去离子水配制7 mmol/L的ABTS溶液及2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液。取过硫酸钾溶液5.00 mL,加入到15.00 mL ABTS溶液中,在室温下置于黑暗处反应16 h,形成ABTS自由基储备液。用体积分数80%乙醇对ABTS自由基储备液进行稀释,使其在734 nm下的吸光度为0.70±0.05,即为ABTS稀释液,备用。取200 μL ABTS稀释液与20 μL样品振荡混匀6 min,在734 nm下测定其吸光度A样品。取200 μL ABTS稀释液与20 μL溶剂振荡混匀6 min,在734 nm下测定其吸光度A空白作为空白对照[17]。按公式计算自由基清除率,以清除率为纵坐标,溶液浓度为横坐标绘图,为能多角度地反映总黄酮、黄酮R、根皮苷的抗氧化能力,采用Trolox作为阳性对照,实验重复三次,取平均值和SD值:

1.3 数据处理

所有数据均为3次重复实验的平均值,通过运用Excel、OriginPro 9.0数据处理软件和Design-Expert.8.05、SPSS 16.0统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响 野金柴总黄酮提取得率随乙醇浓度的变化如图1所示。由图1可知,随着乙醇浓度的增加,野金柴总黄酮提取得率呈现出增加的趋势。当乙醇溶液浓度达到80%后,提取得率的提升幅度明显放缓,基本与乙醇浓度在80%处持平。这可能是由于当乙醇浓度较低时,水分子数量较大,细胞发生溶胀导致离子通道受阻[18],黄酮无法顺利从细胞被分离,而当乙醇浓度达到80%时,黄酮极性与提取液的极性相似,得率最大。因此,选择70%～90%的乙醇浓度作为野金柴总黄酮的最佳提取浓度范围。

图1 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

2.1.2 液料比对总黄酮得率的影响 野金柴总黄酮提取得率随液料比的变化如图2所示。由图2可知,当液料比从10∶1增加到30∶1时,野金柴总黄酮的提取得率呈现出较为明显的增长速度,其原因可能是随着液料比的增长,野金柴细胞溶胀性提高,野金柴细胞与溶剂的接触面积增大[19]。当液料比由30∶1增长到40∶1时,增加趋势基本消失,液料比从40∶1增加到50∶1时,总黄酮提取得率出现下降,这可能是因为溶剂量过多时,一些其他化合物也被提取出来,使得率呈下降趋势[20]。虽然总黄酮提取得率在液料比40∶1时最大,但由于液料比从30∶1增加到40∶1,需要消耗更多的溶剂,且提取得率的增幅并不明显。综合考虑,选择30∶1～50∶1的液料比范围作为野金柴总黄酮提取的最佳液料比范围。

图2 液料比对总黄酮得率的影响

2.1.3 超声功率对总黄酮得率的影响 野金柴总黄酮提取得率随超声功率的变化如图3所示。由图3可知,当功率由300 W递增到500 W时,总黄酮得率呈现出逐步上升的趋势,但当功率由500 W增加到700 W时,总黄酮得率下降。这可能是由于当超声功率在300～500 W范围内时,空化泡的形成随功率的升高而变得更容易,并且空化泡的崩解也随功率的升高而变得更加剧烈;当功率超过500 W后,空化泡增长得过大,以至于不能崩解或者很脆弱的崩解,大大降低了空化作用的效果,并且过多的空化泡也会阻碍超声波的传播[21]。且随着功率的增加,溶液温度可能升高,从而导致黄酮活性发生改变。因此,当其他条件相同时,选择400～600 W的功率范围作为最佳提取功率范围。

表2 Box-Benhnken实验设计和结果

图3 超声功率对总黄酮得率的影响

2.1.4 超声时间对总黄酮得率的影响 野金柴总黄酮提取得率随超声时间的变化如图4所示。由图4可知,随着超声时间的增加,野金柴总黄酮提取得率呈现出增长的趋势,当超声时间到达50 min后,提取得率提升不明显,与超声时间为50 min时差别不大。可能是在超声时间增大的过程中,超声波空化泡作用与空化泡崩解产生的机械作用有利于乙醇溶液进入组织内,加快了黄酮的溶出[22],当时间达到50 min后,组织内大部分黄酮被提取完全,剩余部分极少,增大超声时间也难以提升黄酮得率。且若再增大超声时间,探头的温度会随之增加,导致提取剂的蒸发流失[23-24],可能导致黄酮得率反而下降。因此,在确定其他条件一致时,可选择超声时间40～60 min作为野金柴总黄酮的最佳超声时间范围。

图4 超声时间对总黄酮得率的影响

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面方案设计 选取(A)液料比、(B)乙醇浓度、(C)超声功率、(D)超声时间四个因素,设计三个水平实验,野金柴黄酮得率为响应值。实验设计与结果如表2所示。

2.2.2 方差分析及显著性检测 用软件Design-Expert.8.05对以上数据进行回归分析,结果如表3所示。对各因素回归拟合,可得如下野金柴黄酮得率F(%)的回归方程:

F=+8.81+0.011A+0.11B+0.077C+0.24D-0.078A2-0.089B2-0.23C2-0.23D2+0.013AB+0.038AC+0.018AD+0.0025BC-0.01BD+0.013CD

图5 液料比(A)、乙醇浓度(B)、超声功率(C)、超声时间(D)对总黄酮得率的影响

表3 回归模型的方差分析

2.2.3 最优工艺条件的确定及模型验证 通过Design-Expert软件对回归方程进行计算,得到超声波辅助提取野金柴黄酮最佳工艺条件,在液料比41.93∶1,乙醇浓度82.55%,超声功率539.46 W,超声时间56.49 min的条件下,得到最高的黄酮得率为8.90%。考虑到实际条件的可操作性,将最佳工艺条件调整为:液料比40∶1,乙醇浓度80%,超声功率540 W,超声时间60 min。为验证结果的可靠性,采用上述优化出的工艺参数进行3次重复实验,得到野金柴黄酮的实际得率为8.82%±0.09%。同时,有文献报道,自然存放1个月的多穗柯粗粉总黄酮含量为8.34%,且随着存放时间延长,总黄酮含量不断降低,自然存放3个月后,总黄酮含量降为7.46%[25]。实验所使用的材料野金柴是多穗柯干制叶,参考该结论,与新鲜多穗柯嫩叶相比,存放时间更长的野金柴总黄酮含量更低,本研究优化工艺后,所得的野金柴总黄酮得率较高,说明所得回归方程对野金柴黄酮得率进行分析和预测非常可靠,具有一定的实践指导意义。

2.3 野金柴黄酮抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定 图6显示了不同浓度总黄酮、根皮苷、黄酮R对DPPH自由基的清除率。在一定范围内,野金柴总黄酮、根皮苷、黄酮R对DPPH自由基的清除能力都随浓度的增加而递增,当浓度增加至0.035～0.040 mg/mL时增加趋势放缓。且三者与VC对DPPH自由基的清除能力排序是VC>总黄酮>根皮苷>黄酮R,VC、总黄酮、根皮苷、黄酮R的IC50值分别为0.0190、0.0205、0.0222、0.0261 mg/mL。虽然黄酮R对DPPH自由基的清除能力比总黄酮和根皮苷要稍弱,但从数值上来看,黄酮R依旧有较强的DPPH自由基清除能力。

图6 不同浓度总黄酮、根皮苷、黄酮R对DPPH及ABTS自由基清除率

2.3.2 ABTS自由基清除能力测定 图6显示了Trolox、总黄酮、根皮苷、黄酮R对ABTS自由基的清除效果。一定浓度范围内,Trolox和总黄酮、根皮苷、黄酮R的ABTS自由基清除能力随浓度的增加而增大,呈现一定的量效依赖关系,Trolox、总黄酮、根皮苷、黄酮R的IC50值分别为0.0201、0.0220、0.0233、0.0266 mg/mL。在相同浓度下,Trolox的自由基清除能力最强,黄酮R最弱,原因可能是野金柴总黄酮中的主要成分是根皮苷,黄酮R中含有槲皮苷等具有抗氧化能力的黄酮,但含量相对较少,因此抗氧化能力较低,但仍有较好的ABTS自由基清除能力。

3 结论

本实验使用超声波辅助提取野金柴总黄酮,并对提取工艺进行优化。通过响应面法构建了超声波辅助提取野金柴总黄酮的数学模型,获得了最佳提取工艺。采用ADS-7型大孔树脂对野金柴黄酮中的根皮苷进行初步分离,并对总黄酮、根皮苷和黄酮R的抗氧化活性进行对比研究。结果表明:各提取条件对野金柴总黄酮得率的影响大小关系为:超声时间>乙醇浓度>超声功率>液料比。优化所得最佳提取工艺条件为液料比40∶1,乙醇浓度80%,超声功率540 W,超声时间60 min,此条件下野金柴总黄酮得率为8.82%±0.09%。通过大孔树脂分离所得根皮苷,黄酮R对DPPH自由基和ABTS自由基也有较好的清除效果,是天然的抗氧化资源。目前关于野金柴黄酮的研究大都局限于总黄酮与根皮苷,尚未发现关于野金柴中黄酮R的研究,且对于野金柴的实际工业应用多为提取根皮苷,忽略了对黄酮R进行进一步的生产利用。本实验通过研究野金柴总黄酮、根皮苷与黄酮R的抗氧化能力,证明黄酮R具有优良的抗氧化效果,说明提取完根皮苷的野金柴残渣也可以加以利用,在实际生产中有其较高的利用价值。