慢性胰腺炎发病机制的研究进展

刘广林 张文成 陈凯 许威,

1武警后勤学院，天津 300309；2武警特色医学中心，天津 300162

【提要】 CP是一种以胰腺纤维化及腺泡萎缩和破坏等为主要病理特征的慢性不可逆性疾病，其病因复杂，发病机制尚未明确。近年研究表明，数个易感基因、信号通路及细胞或亚细胞水平的病理生理机制均与CP发病存在不同程度的关联。

CP是一种以胰腺组织纤维化为主要病理特征的慢性不可逆性胰腺疾病，病因包括胆道疾病、长期饮酒、遗传因素、免疫紊乱等，临床表现为反复发作性或持续性腹痛、腹泻及脂肪泻、消瘦、黄疸、腹部包块和糖尿病等。胰腺纤维化的发病机制尚未明确，CP目前的治疗方法也仅限于对症治疗及对并发症的处理，治疗效果不理想，易复发。近年来对CP发病机制及药物治疗的研究有一些新的进展，本文就其遗传学、信号转导通路、胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells, PSCs)、免疫学、细胞代谢等方面的研究进展进行综述。

一、遗传学

近年有研究显示，CP是一种复杂的基因疾病，多种易感基因的突变致使患病的风险增加[1]，如丝氨酸蛋白酶抑制剂 Kazal 1 型(serine protease in-hibitor Kazal 1 type, SPINK1)、囊性纤维化跨膜转导因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)、阳离子胰蛋白酶原(cationic trypsin gene, PRSS1)等基因的突变[2]。一项国内大型临床数据调查研究显示，在多达1 000余例的汉族CP患者中，通过将其基因型与千余例对照者进行对比发现，SPINK1、CFTR、PRSS1、糜蛋白酶C(chymotrypsin C, CTRC)等基因存在数个新的突变型，并证实了突变型基因与CP关系密切，且对患者预后、生存等方面都有极大的影响[3]。

1．SPINK1：SPINK1是研究最早、最广泛的CP易感基因之一，其编码胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂。国内有学者通过SPINK1全长基因模型研究发现，SPINK1 外显子区域共有32个突变，且32个突变均未导致 SPINK1 异常转录本的产生。当真核细胞中的mRNA出现提前终止密码子时，便会出现无义介导的mRNA 降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)，避免被截短的mRNA影响细胞正常功能[4]。突变c.27del C可引发NMD降低mRNA的表达量，且突变c.190A>G、c.199C>T 、c.199C>T均可降低 SPINK1mRNA的相对表达量。利用SPINK1全长基因模型对c.194G>A进行分析，综合考虑c.194G>A的致病作用为错义突变致蛋白分泌减少所致，与前体mRNA异常剪接无关[5]。国内有研究显示，杂合SPINK1 c.194+2T>C基因突变可以引起自发性CP。该研究利用SPINK1+/+基因突变型新生小鼠，给予或不给予雨蛙素处理，分别经过9、11、13周后处死，取胰腺组织进行病理染色，证实了杂合SPINK1 c.194+2T>C突变的易感性[6]。德国学者Buchholz等[7]利用圆二色光谱数据分析揭示出SPINK1和N34S突变体的二级结构的差异，表明蛋白质结构的变化与CP具有相关性；而通过表面离子体共振及胰蛋白酶抑制实验，则显示SPINK1及其N34S突变体对蛋白酶结合力、亲和力及抑制效应相当，结合进一步实验证实， N34S突变引起的蛋白质结构变化可能为非损伤性改变，而环境pH则可以通过多种方式诱导蛋白质结构的变化，是CP病理过程的关键一点。

2．CFTR与CTRC：CFTR是ATP结合盒转运蛋白超家族的成员，其主要功能是调节cAMP依赖的氯离子通道。国内学者对1 061例汉族CP患者及1 196例对照者进行二代基因测序分析，结果显示SPINK1、PRSS1、CTRC及CFTR基因突变显著影响CP患者的发病年龄及临床预后，其作用机制与基因-环境之间的相互作用有关[3]。CFTR参与CP病理过程的机制大致涉及以下两个方面：首先，CFTR的突变导致氯离子向细胞外转运障碍，从而增加了胰液的黏稠度和厚度，黏液堵塞胰管致使胰腺外分泌障碍、营养吸收不良[8-9]；其次，CFTR突变引起细胞内离子流失衡，促使谷氨酰胺转移酶的激活及beclin1表达量的降低，蛋白质稳态受到严重影响，并抑制细胞自噬[10]。

CTRC基因与CP的关系曾饱有争论。法国学者以253例青年CP患者为研究对象，发现CTRC的表型与CP的发生相关的病例仅占4.3%[11]。有研究认为CTRC基因的变异与CP不存在相关性[12]。近期Geisz等[13]利用CTRC基因外显子2单核苷酸缺失的C57/6小鼠恢复CTRC的一个功能位点，并通过雨蛙素制备急慢性胰腺炎小鼠模型后发现，CTRC功能位点恢复组的小鼠疾病严重程度有所下降；进一步实验则证实CTRC是通过介导胰蛋白酶原降解减轻了雨蛙素诱导的腺泡内胰蛋白酶的激活。

二、信号转导通路

NF-κB是一系列同源或异源Re1家族成员形成的二聚体转录因子的总称。国内有学者利用雨蛙素诱导小鼠胰腺炎做研究，结果显示增加腺泡细胞NF-κB活性伴随着细胞因子高表达和胰腺炎加重，持续性的高 NF-kB 活性能够导致CP发生，即NF-κB活化通过对炎症的影响来恶化胰腺炎的进程[14]。也有学者利用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导PSCs LTC-14细胞株中NF-κB表达和核易位，发现LPS引起LTC-14细胞NF-κB mRNA及其蛋白表达量增高, NF-κB核内易位量明显增加，氧化苦参碱干预可下调NF-κB mRNA和蛋白表达，抑制NF-κB核内易位[15]。

Hedgehog基因最早在1980年由Nusslein-Volhard和Wieschaus两名学者研究果蝇的基因时被发现[16]。在胰腺发育过程中，hedgehog信号通路中的Hh蛋白参与调控胰腺的正常发育和胰岛细胞、胰腺形态的发生，而在正常的成熟胰腺组织中无表达或仅轻度表达[17]。Hh蛋白表达异常与胰腺慢性炎症的发生、发展密切相关。国内学者在Wistar大鼠尾静脉注射二氯二丁基锡建立CP模型，采用免疫组织化学方法检测到实验组胰腺组织Hh蛋白高度表达，同时采用RT-PCR法检测到其mRNA水平高度表达[18]，由此可见Hedgehog通路在CP中有异常激活的表现。

三、PSCs

Bynigeri和Jakkampudi[19]认为PSCs的激活是各种胰腺疾病尤其是胰腺纤维化、CP和胰腺导管腺癌病理过程的关键，这一过程依赖于多种细胞因子及相关的信号通路。

Charrier等[20]利用酒精性CP小鼠模型，通过对胶原等纤维化相关指标的检测后发现，活化的PSCs产生的结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CCN2)与miR-21的表达之间存在正反馈关系，证实了miR-21-CCN2轴是PSCs纤维化信号系统中的一项重要成分。在PSCs发挥作用的机制中，自噬起到了关键性的作用。Endo等[21]利用自噬相关蛋白5(autophagy related 5，ATG5)基因敲除小鼠与野生型小鼠对比，进行组织、免疫组织化学、转录、代谢等分析发现，实验组小鼠中雄性小鼠发生CP的比例高于雌性小鼠，与对照组相比，实验组胰腺组织产生更高水平的活性氧，并缺乏对谷氨酸依赖的代谢的激活，推测自噬的缺陷通过谷氨酸依赖的代谢及活性氧产生的增加对CP的发生、发展产生一定影响。国内学者通过转录组测序分析发现，活化的PSCs中视网膜母细胞瘤螺旋蛋白1(retinoblastoma coiled coil protein 1，RB1CC1)和自噬水平明显升高，自噬也能促进PSCs活化，当RB1CC1基因被敲低时，自噬流及PSCs活化的程度明显减低；进一步的细胞实验证实，RB1CC1通过与ULK1启动子结合并与ULK1相互作用诱导PSCs活化，动物实验则显示RB1CC1表达降低使小鼠的胰腺纤维化有所减轻[22]。

早期研究显示，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase ，MAPK)信号通路参与调节PSCs功能，进而促进胰腺纤维化。而近些年国内学者通过离体、在体实验证实，在CP组织中MAPK家族的p-JNK、p-ERK及p-p38表达量均有升高，通过应用MAPK抑制剂进一步实验发现，JNK、ERK直接参与PSCs的活化和胰腺纤维化，p38则参与了CP的发展[23]。

四、免疫学

早期的动物和人类研究表明，T细胞和巨噬细胞是CP的主要免疫细胞浸润[24]，T细胞在CP中的作用也已被提出[25]。根据组织学观察，巨噬细胞与PSCs非常接近，提示巨噬细胞在CP中的潜在作用[26]。近期Xue等[27]研究发现，小鼠和人类的PSCs中有大量的IL-4/IL-13，而在离体实验中通过药物抑制IL-4/IL-13，发现小鼠及人类CP模型的胰腺组织中选择性激活的巨噬细胞减少，胰腺组织纤维化减轻，该结果说明巨噬细胞数量在小鼠和人类CP的胰腺组织中增加，选择性激活的巨噬细胞促进了胰腺组织纤维化的发生，而PSCs在巨噬细胞选择性激活的诱导中发挥了重要作用。

随着研究的深入，免疫信号分子在CP中发挥作用的研究也取得了一定的进展。Sendler等[28]利用补体C5缺陷小鼠以及C57BL/6作对照，采用胰腺中断结扎、雨蛙素腹腔注射等方法制备胰腺炎模型进行实验，发现在胰腺炎发生的初始阶段，无论是C5缺陷的实验组还是对照组，胰腺的损伤程度相近，而随着病情的进展，在缺乏C5的小鼠体内或者在小鼠体内注射激活态C5受体拮抗剂的CP小鼠模型中，胰腺纤维化水平较对照组显著减轻；离体实验可见PSCs被C5a激活。另有国内学者利用导管内注入三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)诱导SD大鼠制作CP模型，结果显示实验组CP模型大鼠的趋化因子CXCL9蛋白表达明显上调，在体实验中CXCL9可以减弱由TNBS诱导的CP胰腺纤维化，离体实验中可以观察到CXCL9的抗纤维化作用，并可以抑制活化的PSCs产生胶原蛋白[29]。

五、细胞代谢

大量的动物和临床研究表明慢性氧化应激在CP病程中起关键作用，并使CP的临床和组织学症状(疼痛和组织性坏死)持续存在。而运用抗氧化剂减轻CP疼痛的研究又进一步证实了氧化应激这一理论。近期有学者将C57BL/6小鼠体内分离出的PSCs暴露于具有抗氧化和清除自由基功能的辅酶Q10中72 h后发现，氧化应激阳性细胞以及细胞氧化应激的代谢产物水平显著减低，且该研究还证实辅酶Q10可以通过激活PI3K/AKT/mTOR通路抑制PSCs的活化，即抑制CP时胰腺纤维化这一病理过程[30]。国外亦有研究证实，炎症诱导的氧化应激可以通过调节Nrf2/NF-κB和SAPK/JNK通路导致胰腺细胞的死亡[31]。

Sah等[32]认为CP的发病并不是以胰酶为中心，而是独立于胰酶之外的发病机制 。该团队对小鼠CP模型及CP患者的胰腺组织进行病理染色，并进行了细胞和组织等不同水平的实验。结果显示，内质网应激在CP中存在慢性、持续性激活，由此证明了内质网应激与CP存在相关性；通过敲除小鼠胰蛋白酶原7基因发现，内质网应激的发生可独立于胰酶体系之外，是一项独立的致病因素[33]。

综上所述，CP的病因复杂，胰腺间质纤维组织的增生和腺泡的萎缩及破坏使胰腺的内外分泌功能受损，仍是CP治疗所面临的难题，其临床治疗效果并不理想。虽然近年来国内外不同学者的研究也为CP的治疗方面提供了新的思路和启示，有很多地方值得进一步去研究，但同时也表明CP的发病机制仍缺乏全面的、成熟的理论体系，其发生发展仍有待进一步研究探讨。

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