吸氢对大鼠颅脑损伤引起的急性炎症反应的抑制作用

琚芳迪,谢飞*,郭大志,赵清辉,何晋,姚婷婷,赵鹏翔,潘树义,马雪梅*

1.北京工业大学生命科学与生物工程学院, 北京 100124; 2.中国人民解放军总医院第六医学中心, 北京 100048

创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是由外力引起的大脑功能或病理学改变。每年全世界大约有1 000万人遭受TBI，并且相当多患者因此暂时或者永久残疾、甚至死亡[1]。最新统计数据表明，在我国TBI的致死率约为13例/10万人口[2]，预计颅脑损伤将成为负担最重的第三大疾病[3]。TBI发生后经初始损伤和继发性损伤导致脑功能障碍，其中继发性损伤引起的脑水肿是造成患者残疾和死亡的首要原因。临床上用于治疗TBI的药物主要包括钙拮抗剂、糖皮质激素、甘露醇以及内源性脑保护因子等，虽然这些药物可以在一定程度上促进神经功能的恢复，然而到目前为止还没有一种药物具有确切的临床疗效。

氢气(hydrogen)是世界上已知最轻的气体，无色、无嗅、无味，有还原性，在水中溶解度较低。人体肠道中某些细菌可通过代谢作用产生少量氢气，并通过人体的消化、呼吸系统排出体外[4]。但正因为缺乏内源性代谢途径，氢气的医学作用长期以来并未得到重视。2007年，Ohsawa等[5]的研究表明，吸入2%的氢气可显著缓解脑缺血损伤，并提出氢气可通过选择性清除毒性氧自由基发挥生物学作用。随后关于氢气生物学作用的研究大量涌现。由于具有分子小、易渗透的特点，氢分子很容易穿过血脑屏障，为其在神经系统尤其是脑损伤中发挥保护作用提供了有利条件。近年来的研究表明，通过吸氢、饮用富氢水或注射富氢生理盐水等多种方式均可显著缓解TBI后的脑功能损伤[6-11]。然而，关于氢气的作用机理的研究目前还处于初级阶段，其中抗氧化、抗炎症、抗凋亡以及调节信号通路均只能部分解释氢分子对某些疾病的保护作用[12-13]，因此深入探究氢分子的作用机理仍然是目前氢分子生物学研究亟需解决的问题。

以往研究曾报道富氢水可能通过抑制炎症反应来发挥其对TBI后脑损伤的保护作用[8-9]，然而关于吸入氢气对TBI急性炎症反应的影响的研究较少。已有研究显示，吸氢24 h即可显著缓解TBI后的脑功能损伤，提示吸氢可能对TBI后急性炎症反应起到抑制作用[6]，因此本研究主要针对吸入氢气对TBI急性期内炎症反应的影响进行深入研究。为了深入探索氢分子对TBI后急性炎症反应的影响，采用悬浮芯片技术监测TBI后24 h内血清中23种细胞因子水平的变化；TBI后24 h采用改良的神经功能缺失评分法(modified neurological severity score，mNss)评估吸氢的神经保护作用，同时取脑组织进行尼氏染色分析并对血清生化指标进行检测，以期为进一步研究氢分子对TBI保护作用的机理提供更多线索，同时也为未来氢气在TBI临床治疗中的应用提供更多理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

尼氏染色液(武汉博士德生物工程有限公司)；Bio-Plex ProTM大鼠23细胞因子多重检测试剂盒(美国Bio-rad公司)。PCI3000精密打击器(美国Hatteras Instruments公司)；SG-3000型氢氧气雾化机；气相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；悬浮芯片系统(美国Bio-rad公司)；2400全自动生化分析仪(西门子(中国)有限公司)。

1.2 实验动物及分组

6周龄雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠自由饮水进食，饲养于22～25 ℃、12 h/12 h明暗交替的清洁级动物实验室内，建模前大鼠需要适应环境1周时间。大鼠随机分为3组(每组20只)：假手术组(仅开骨窗，未进行打击；sham组)；颅脑损伤组(TBI组)；颅脑损伤后的氢气治疗组(HI组)。其中，每组8只大鼠用于TBI后24 h mNss评分、血清生化指标检测和尼氏染色分析，另外12只大鼠用于TBI后2、6和24 h细胞因子检测(每个时间点4只大鼠)。

1.3 TBI模型的建立

TBI模型采用了目前比较公认的控制性皮层冲击损伤(controlled cortical impact，CCI)模型[14]。具体方法如下：将大鼠放在诱导箱中采用3%异氟烷进行吸入麻醉后从诱导箱中取出，在面罩下继续吸入异氟烷以维持麻醉。待大鼠后肢退缩反射消失后，将大鼠置于立体定向框架内。沿中线切开头皮约2.0 cm，钝性分离骨膜，3% H2O2去除骨膜，暴露前囟和后囟。调节定位仪使打击头距前囟3.5 mm、距中线左侧3.0 mm，用牙钻钻一个直径为6.0 mm的骨孔，并保持硬脑膜的完整性。使用Hatteras Instruments PCI3000精密打击器进行打击，打击头直径为5.0 mm，打击速度为4.0 m·s-1，打击深度为6.0 mm，滞留时间500 ms。打击完成后观察大鼠的呼吸情况，确认无误后，用生理盐水冲洗并用碘伏消毒后用骨蜡封闭，最后缝合头皮。

1.4 吸氢处理

氢气发生器由SG-3000型氢氧气雾化机与气体混合器组成，将氢气发生器与透明封闭塑料箱(长×宽×高：72 cm×53 cm×45 cm)相连，测量箱内氢气浓度，并通过调节气体流量使得箱内氢气浓度为4%，氧气浓度约为21%。HI组大鼠在建模后立即进行吸氢处理，将大鼠放入箱中吸氢1 h，8 h后再吸氢1次。采用气相色谱仪对密闭箱中的氢气和氧气浓度进行监测。

1.5 神经功能缺失评分

在颅脑损伤后24 h采用mNss评分法对各组大鼠进行评估，具体方法参考Chen等[15]的研究。mNss评分法包括对大鼠运动、感觉、平衡能力和反射功能进行评估，总分0～18分，分值越大说明大鼠的神经功能缺失越严重，1～6分为轻度损伤、7～12分为中度损伤、13～18分为重度损伤。

1.6 脑组织神经元尼氏染色

颅脑损伤后24 h取血后处死大鼠，取脑皮质损伤区组织用甲醛固定后进行石蜡包埋。石蜡包埋组织行冠状切片(厚度为4 μm)后用二甲苯脱蜡并进行梯度乙醇水化，然后将切片用尼氏染色液染色5 min。染色后再经脱水和透明后进行封片镜检。

1.7 血清生化指标和细胞因子检测

1.7.1血液采集和处理方法 3%异氟烷大鼠麻醉后，用毛细管在眼眦静脉丛取血约1 mL置于含促凝剂的采血管中，室温放置30 min后，以3 000 r·min-1离心10 min，取上清用于血清细胞因子和生化指标检测。

1.7.2细胞因子检测 在Bio-rad悬浮芯片系统上采用Bio-Plex ProTM大鼠23细胞因子多重检测试剂盒对血清中的细胞因子浓度变化进行监测，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。23种细胞因子包括：白介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-2(interleukin-2，IL-2)、白介素-4(interleukin-4，IL-4)、白介素-5(interleukin-5，IL-5)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-7(interleukin-7，IL-7)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-12(interleukin-12，IL-12)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)、白介素-17(interleukin-17，IL-17)、白介素-18(interleukin-18，IL-18)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、生长相关致癌基因(growth-regulated oneogene-KC，GRO-KC)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-3α(macrophage inflammatory protein-3α，MIP-3α)、T细胞表达分泌的活性调节蛋白(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。

1.7.3生化指标检测 采用西门子全自动生化分析仪2400进行生化指标检测。操作方法严格按照仪器使用说明进行。生化指标包括：空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、尿酸(uric acid，UA)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、高密度脂蛋白-胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)和a-羟基丁酸脱氢酶(a-hydroxybutyrate dehydrogenase，HDB)。

1.8 数据处理方法

采用GraphPad Prism 8.0.2进行数据统计分析，两组数据之间的比较使用非配对t-test方法，结果以Mean±SEM表示，P<0.05视为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 吸氢对TBI后神经功能损伤的影响

为了探究吸氢对TBI后神经功能损伤的影响，在颅脑损伤后24 h采用mNss评分法对各组大鼠进行评估。mNss评分结果表明，与sham组相比，TBI组大鼠在TBI后24 h mNss评分明显升高，而吸氢组(HI)mNss评分与TBI组相比显著降低(P<0.05)，提示吸氢对TBI引起的神经功能损伤具有保护作用(图1)。

2.2 吸氢对TBI引起的神经元损伤的保护作用

为了进一步验证吸氢对TBI引起的神经元损伤的保护作用，在颅脑损伤后24 h取血后处死大鼠，取脑皮质损伤区组织切片进行尼氏染色分析。结果表明，与sham组相比，TBI组大鼠在TBI后24 h神经元数目显著减少(P<0.001)，同时出现很多尼氏染色较深的神经元(即为损伤神经元)，提示神经元受损严重。与TBI组相比，吸氢组(HI)神经元数目显著增多(P<0.05)，同时尼氏染色较深的神经元(即为损伤神经元)数目相对减少，提示吸氢对TBI引起的神经元损伤有很好的保护作用(图2)。

2.3 吸氢对血清细胞因子的影响

为了进一步研究TBI大鼠吸氢后对血清中细胞因子的影响，实验中选取了TBI急性期的3个时间点(2、6和24 h)对血清中23种细胞因子的浓度变化进行了监测。结果表明，大鼠TBI后24 h内血清中细胞因子的变化主要呈现以下4种情况。①TBI后2 h细胞因子浓度升高，24 h内随时间的推移浓度逐渐下降。符合该变化趋势的细胞因子包括：IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ、GRO-KC和MCP-1。②TBI后细胞因子浓度逐渐升高，到第6 h达到顶峰，然后又逐渐下降。符合该变化趋势的细胞因子包括：IL-4、IL-12、TNF-α、G-CSF、M-CSF、MIP-3α和VEGF。③从TBI后2 h开始就呈现下降趋势的，这类细胞因子包括：IL-18和RANTES。④在TBI后24 h内无明显变化的细胞因子，包括IL-1α、IL-7、GM-CSF和MIP-1α(图3)。

A：大鼠脑组织神经元尼氏染色结果；B：单位面积神经元数目；*和***分别表示处理组与Sham组间或处理组间(带连接线)的差异在P<0.05和P<0.001水平上具有统计学意义。图2 吸氢对TBI急性期神经元的影响Fig.2 Effect of hydrogen inhalation on neurons in the acute phase after TBI

注：*、** 、*** 和**** 分别表示处理组与Sham组间或处理组间(带连接线)的差异在P<0.05、P<0.01、P<0.001和P<0.000 1水平上具有统计学意义。图3 吸氢对TBI急性期血清细胞因子的影响Fig.3 Effect of hydrogen inhalation on serum cytokines in the acute phase after TBI

与TBI组大鼠相比，吸氢组(HI)大鼠有7种促炎细胞因子在TBI后2 h明显降低，其中包括IL-1β(59.81%)、IL-17(58.22%)、IL-6(51.56%，P= 0.0834)、IL-13(49.44%)、IFN-γ(37.53%)、IL-2(37.51%)和IL-5(16.11%)，但差异不具有统计学意义(P> 0.05),以上细胞因子的血清浓度在6 h和24 h内的变化均小于2 h;有7种细胞因子(主要是趋化因子)在TBI后2 h升高，其中包括M-CSF(137.13%，P=0.017 0)、GRO-KC(91.18%)、G-CSF(77.18%)、MIP-3α(75.21%)、IL-7(63.05%)、IL-12(45.88%)、IL-1α(40.61%)，除M-CSF外差异均不具有统计学意义(P>0.05)；除以上细胞因子外，VEGF在TBI后6 h明显升高(33.31%，P>0.05)(图3)。

2.4 吸氢对血清生化指标的影响

研究中还对血清中的生化指标进行了检测。结果表明，TBI后24 h下列生化指标呈现升高趋势，包括FBG(22.03%，P=0.023 2)、TG(54.87%，P=0.093 5)、AST活性(69.70%，P>0.05)、ALT活性(80.51%，P>0.05)、LDL-C(15.89%，P>0.05)、CK活性(30.24%，P>0.05)、CK-MB活性(60.58%，P=0.038 1)和HDB活性(35.93%，P>0.05)。此外，UA水平有降低趋势(27.03%，P=0.053 8)，而TC、HDL-C和LDH活性则无明显变化。与TBI组相比，吸氢组(HI)TC(20.23%，P=0.052 2)、HDL-C(19.87%，P>0.05)、FBG(P>0.05)明显升高，而TG(26.29%，P>0.05)、UA(P>0.05)、AST活性(23.04%，P>0.05)、ALT活性(26.47%，P>0.05)、LDL-C(16.16%，P>0.05)、LDH活性(46.08%，P=0.002 7)、CK活性(30.40%，P>0.05)、CK-MB活性(35.88%，P=0.034 3)以及HDB活性(59.13%，P=0.014 9)均明显下降(图4)。

3 讨论

氢气在创伤性颅脑损伤中的保护作用已有多篇报道，在这些研究中氢气的摄入方式主要有3种：吸氢、饮用富氢水和注射富氢生理盐水。其中，饮用富氢水和注射富氢生理盐水均连续干预7 d[7-10]，而吸氢仅在TBI后5 h内一次性干预[6, 11]，提示吸氢对TBI的保护作用可能更好。以往关于3种氢气摄入方式的比较研究表明，采用吸氢方式摄入氢气后脑组织中氢气浓度可以维持1 h以上，而采用另外2种氢气摄入方式脑组织中氢气浓度仅能维持5～30 min[16]，这可能是吸氢对TBI保护作用更好的原因之一。本研究中，神经功能评分表明，TBI大鼠吸氢后24 h内神经功能就有显著改善，尼氏染色进一步验证了吸氢对神经元的保护作用。

注：*和**分别表示处理组与Sham组间或处理组间(带连接线)的差异在P<0.05和P<0.01水平上具有统计学意义。图4 吸氢对TBI后血清生化指标的影响Fig.4 Effects of hydrogen inhaltion on biochemical indexes in serum after TBI

TBI后中枢神经系统(central nervous system，CNS)的炎症反应是继发性损伤的重要原因之一[17-18]。TBI急性期由于炎症反应会分泌大量促炎因子，引起血管通透性增加，进而导致脑水肿和颅内压升高，最终导致神经细胞死亡。最近研究表明，TBI后患者外周血中IL-1、IL-6、IL-8、IL-10以及TNF-α水平明显升高，且持续时间可长达3个月。其中，促炎因子IL-6与抗炎因子IL-10水平升高尤为明显[19-20]。动物实验结果表明，大鼠在TBI后24 h内脑组织中多种细胞因子水平均显著升高，其中包括10种细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17α、IL-18、IFN-α和TNF-α)和4种生长因子(EGF、GM-CSF、Leptin和VEGF)[21]。与脑组织相比，TBI对外周血中细胞因子的影响相对较小，并且有些细胞因子的变化趋势在不同研究中并不一致。如Keshavarzi等[22]研究发现，大鼠TBI后24 h血清中IL-10水平并无显著性变化，IL-1β水平则显著降低。Ma等[23]的研究表明，大鼠在TBI后24 h内，血清中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α水平均显著升高，该结果与本研究基本一致。除以上4种细胞因子在TBI后24 h内显著升高外，本研究还发现其他9种细胞因子水平在TBI后明显升高，该结果提示，TBI后24 h内大鼠机体炎症反应明显升高。

本研究的重要发现是，在TBI急性期，吸氢组有7种促炎细胞因子明显降低，其中包括IL-1β、IL-6、IFN-γ等，说明氢分子对TBI后急性炎症反应具有明显的抑制作用。考虑到TBI后在短时间内(2 h)即有大量促炎因子水平急剧升高，而吸氢可以对这种促炎因子的集中爆发有明显的抑制作用，由此推测吸氢可能对由病毒(如新冠病毒)感染等其他因素引起的细胞因子风暴有一定的抑制作用。此外，研究中还发现吸氢后有些细胞因子的血清浓度明显升高，其中主要包括一些趋化因子，如M-CSF、G-CSF、GRO-KC和MIP-3α，这些趋化因子仅在TBI后2 h有升高趋势，而在TBI后24 h吸氢组与TBI组无显著差异。研究表明，M-CSF、G-CSF等趋化因子对脑损伤后的神经恢复有保护作用[24-25]，推测在TBI早期氢分子可能通过上调这些趋化因子来发挥保护作用。

研究表明，TBI会导致儿茶酚胺的释放，进而导致糖原分解增加同时胰岛素分泌受到抑制，最终引起血糖水平升高[26-27]，同时血液中儿茶酚胺水平的升高还会导致心脏功能受损[27]。本研究中血清生化指标检测结果表明，TBI后24 h血清中FBG浓度显著升高，此结果与以往报道[26-27]一致。同时，研究结果还表明，作为心脏功能的标志物，LDH、CK、CK-MB以及HDB活性在TBI后明显升高，提示TBI导致心脏功能受损。虽然吸氢并未抑制FBG水平的升高，但是与TBI组相比，以上4种心肌酶的活性在吸氢后均明显下降，提示吸氢对TBI引起的心脏功能损伤有很好的保护作用。除以上4种酶外，以往研究中也报道过AST和ALT酶活的升高与脑损伤严重程度成正比[28]。作为肝脏功能的标志物，吸氢后这2种酶的活性与TBI组相比也明显下降，进一步说明吸氢后脑损伤程度有所缓解，同时也提示吸氢对TBI引起的肝脏功能损伤有保护作用。研究表明，血清中TC水平的升高与TBI后脑损伤的程度成反比[29]。本研究中与TBI组相比，吸氢后TC水平明显升高(P=0.052 2)，进一步说明脑损伤程度明显降低。同时吸氢后HDL-C水平也升高，而LDL-C水平则有所下降，提示TC水平的升高可能是由于HDL-C的升高引起的。此外有研究表明，TBI患者血清中TG水平显著升高[30]，而在本研究中，大鼠TBI后血清TG水平也明显升高，吸氢后这种升高趋势得到了明显缓解。有研究认为，血清中的低水平UA可能是TBI预后良好的标志[31]。本研究中与TBI组相比，吸氢后血清UA水平有降低趋势，说明吸氢对TBI具有一定的保护作用。

综上所述，本研究对大鼠TBI急性期外周血中的细胞因子进行了监测，并通过吸入氢气的方式进行干预，与以往的氢气摄入方式有所不同[8-9]。结果表明吸入氢气可以明显抑制TBI后的急性炎症反应，表现为7种促炎细胞因子血清水平的降低。同时，吸氢还可缓解TBI引起的心脏和肝脏标志物的升高，提示吸氢对TBI引起的心脏和肝脏功能损伤也有很好的保护作用。本研究不仅为氢气对TBI的神经保护作用机理研究提供了很多新的线索，同时也为其在TBI临床治疗中的进一步应用提供了更加坚实的理论基础。