川西高原野樱桃果酒发酵条件优化及其风味成分分析

雷 丹,吴 敏,胡 琼,唐 洁,张 庆

(西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039)

川西高原野樱桃又名苦樱桃、酸樱桃,为蔷薇科落叶乔木植物果实,成熟期较早,有“早春第一果”之美誉。野樱桃果实色泽艳丽,风味独特,富含糖、蛋白质、维生素及钙、铁等多种元素,营养价值高;且川西野樱桃在生长过程中几乎不使用农药,属无公害果品[1],深受消费者喜爱。随着对野樱桃认知的深入,其市场需求量逐年增加。然而野樱桃采摘周期短,果皮薄不耐运输,并且货架期和储存期也远低于市场上出现的苹果、梨等水果,从而易造成大量鲜果堆积腐烂。将野樱桃开发成具有高附加值的野樱桃果酒,既可以最大程度保留野樱桃的营养价值,又可以延长其货架期,符合当前追求天然且有益于健康的饮酒潮流[2],具有广阔的市场前景。

樱桃果酒中香气组成包括天然香气、发酵香气和陈酿香气[3],大部分香气物质多为果酒陈酿过程中形成的副产物,是构成和反映果酒生产工艺、果酒品质及典型性的主要因素。在果酒酿造过程中,陈酿时间长短对香气成分及含量产生重要影响[4]。目前为止,酒的风味成分分离萃取技术包括静态顶空法[5](Static headspace)、动态顶空法[6](Dynamic headspace)、固相微萃取[7](Solid-phase extraction)、以及液-液萃取(Liquid-liquid extraction)[8]等,其中固相微萃取技术凭借技术方便、成本低、灵敏度高且重现性好[9-10],广泛运用于黄酒[11]、米酒[12]、坚果露酒[13]、葡萄酒[14]等各类酒的挥发性成分研究。

本研究以川西高原野樱桃为原料,采用单因素和响应面分析法对其发酵工艺参数进行优化,以确定野樱桃果酒的最佳工艺条件;并通过顶空固相微萃取(Headspace solid-phase microextraction HS-SPME)与气相色谱-质谱联用技术(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)对不同陈酿时间野樱桃果酒中挥发性风味物质进行分析鉴定,对主要风味物质进行主成分分析,筛选出野樱桃果酒特征风味成分,以期为川西高原藏区野樱桃果酒生产过程提供可靠的科学依据,促进野樱桃产业快速发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜野樱桃 川西藏区阿坝州小金县;白砂糖(食品级) 市售;果胶酶(10000 U/g) 美国Sigma公司;果酒专用酵母 湖北安琪酵母股份有限公司;柠檬酸 天津市致远化学试剂有限公司;氯化钠(分析纯)、K2S2O5(食品级) 天津市瑞金特化学品有限公司。

LPS-5离心式破碎机 旭郎机械成都分公司;DHP-9052电热恒温培养箱 上海益恒实验仪器有限公司;WBL25C56榨汁机 美的(Midea)集团股份有限公司;气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司;固相微萃取针头 75 μm CAR/PDMS、手动进样手柄 美国Supelco公司;酒精计 武强滏阳仪表厂;WYT-J型手持糖度计 成都光学厂。

1.2 实验方法

1.2.1 野樱桃果酒酿造工艺流程

1.2.2 操作要点 原材料预处理:挑选新鲜成熟、无虫害野樱桃,清洗干净、去核去皮。

榨汁打浆:将预处理好的野樱桃榨汁打浆作为果酒发酵液。

酶解处理:果酒发酵液中添加质量分数0.3%的果胶酶,40 ℃恒温搅拌维持2 h。

调配:添加适量SO2(K2S2O5),以抑制杂菌生长;添加适量白砂糖,调整野樱桃果浆含糖量(原始含糖量为9 °Bx)。

酵母活化:取果酒专用干酵母,加入料液比1∶20的糖水,40 ℃活化30 min[3]。

发酵:将适量活化酵母接种至野樱桃发酵液中,将贮酒罐放于培养箱中密封发酵15 d。

陈酿:将发酵后的酒样转入储酒罐中进行陈酿,于15 ℃满罐放置半个月,陈酿期间定期(10、12、14、16 d)观察其挥发性成分的变化。

1.2.3 野樱桃果酒发酵的单因素实验 由于酒精度对果酒风味影响较大[15],故以酒精度为考察指标。固定果酒发酵初始糖度为18 °Bx、初始酵母接种量为5%、发酵温度为25 ℃进行发酵,考察偏重亚硫酸钾为(50、75、100、125 mg/L)对野樱桃果酒发酵的影响;固定偏重亚硫酸钾添加量为75 mg/L、初始酵母接种量5%、发酵温度25 ℃进行发酵,考察初始糖度为(17、18、19、20 °Bx)对野樱桃果酒发酵的影响;固定偏重亚硫酸钾添加量为75 mg/L、初始糖度18 °Bx、发酵温度25 ℃进行发酵,考察酿酒酵母接种量(1%、3%、5%、7%)对樱桃果酒发酵的影响;固定偏重亚硫酸钾添加量为75 mg/L、初始糖度18 °Bx、初始酵母接种量5%进行发酵,考察发酵温度为(15、20、25、30 ℃)对樱桃果酒发酵的影响。

1.2.4 响应面优化试验 在单因素实验结果基础上,根据Box-Behnken响应面设计原理,选择K2S2O5添加量、初始糖度、酵母接种量及发酵温度等因素为考察变量,分别以A、B、C和D表示,并以-1、0、1表示变量水平,以酒精度(Y)为响应值进行优化,每组实验重复3次。因素水平及编码见表1。

表1 Box-Behnken设计实验因素水平

1.3 指标测定

1.3.1 理化指标 糖度测定:手持折光仪法;酒精度测定:酒精计测定,以体积百分比计算[15];SO2测定:直接碘量法。

1.3.2 野樱桃果酒风味成分分析

1.3.2.1 样品前处理 取5 mL陈酿果酒于15 mL顶空萃取瓶,加入1.0 g NaCl[16],加盖密封,于60 ℃水浴平衡30 min,将已老化的固相微萃取器插在样品瓶上吸附40 min。萃取结束后,于气相色谱仪220 ℃解吸5 min,进行GC-MS检测分析[17]。

1.3.2.2 GC-MS检测条件 气相色谱条件:进样口温度250 ℃,升温程序:起始温度42 ℃保持2 min;以4 ℃/min升温至82 ℃,保持2 min;以8 ℃/min升温至130 ℃,保持2 min;以14 ℃/min升温至200 ℃,保持7 min;以20 ℃/min升温至240 ℃,保持10 min。载气He,流量1.2 mL/min,分流比3∶1。

质谱条件:电子电离(electron ionization,EI)源,离子源温度230 ℃,电子能量70 eV,接口温度250 ℃,扫描范围30.00～500.00 amu[18-19]。

挥发性风味物质经检索,与NIST谱库(107 k Compounds)及Wiley谱库(320 k Compounds)匹配,并结合香精香料标准谱库分析可能属于野樱桃果酒的风味物质,取匹配度不低于80%的组分;同时采用峰面积归一化法计算各挥发性风味物质相对百分含量。

1.4 数据处理

实验数据采用Design-Expert V 8.0.6、SPSS 22.0软件进行分析,采用Origin 8.0、Excel 2010进行作图,因子分析采用主成分分析法。

2 结果与分析

2.1 不同野樱桃果酒发酵条件的对酒精度的影响

K2S2O5对果酒具有抑菌、抗氧化、护色、提高酒精度等作用。但过量添加会抑制酵母菌繁殖,导致发酵减慢,并使果酒具有明显SO2刺激性气味;添加不足,果醪易氧化,从而影响果酒成品风味[20]。由图1a可知,K2S2O5添加量为75 mg/L时果酒酒精度为10.8%vol,因此选择K2S2O5添加量75 mg/L。

图1 不同因素对果酒酒精度的影响

适量糖度可为酵母发酵提供足够能源,对发酵产酒精及芳香物质有重要影响。糖度过高会产生高渗透环境,从而抑制酵母菌生长[20],阻碍糖转化为酒精;糖度过低会使酵母生长缓慢,导致发酵不能正常进行。由图1b可知,随初始糖度增加,果酒酒精度呈先增加后降低趋势,初始糖度过高或过低,果酒发酵酒精度均不高。因此选择发酵初始糖浓度19 °Bx。

酵母接种量对酒精发酵有重要作用。酵母接种量过低,会导致自身代谢生长迟缓,发酵不彻底[9];酵母接种量过高,会加快酵母自身新陈代谢,使转化为酒精的糖分被大量消耗,同时伴随着代谢物生成,酵母发酵环境质量降低,从而出现早衰和自溶,使得酒精度下降[21]。由图1c可知,在野樱桃果汁中加入5%的酵母,酒精度含量较高,因此选择酵母接种量5%。

发酵温度会直接影响酵母的生长繁殖,从而对酒精的生成以及风味物质的产生起重要作用[4]。由图1d可知,在15～25 ℃发酵温度条件下,果酒酒精度逐渐增加,当发酵温度超过25 ℃时,酒精度呈现下降趋势,可能由于温度升高,酵母代谢速率加快,加速酵母进入衰亡期,从而影响酒精生成量以及糖转化量[22]。因此选择25 ℃为野樱桃果酒发酵温度。

2.2 野樱桃果酒发酵工艺的优化

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据单因素实验结果,选择K2S2O5添加量(A)、初始糖度(B)、酵母接种量(C)和发酵温度(D)为自变量进行Box-Behnken中心组合试验设计,以酒精度为响应值,响应面试验设计方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果

利用Design-Expert软件对表2中响应值进行二次线性回归拟合,得到二次多项式回归方程预测模型为:

Y=10.84+0.22A-0.38B+0.66C-0.14D-0.32AC+0.025AD+0.25BC-0.1CD-0.17A2-1.05B2-1.76C2-0.56D2

2.2.2 方差分析 对上述二次回归方程进行统计分析,结果见表3。

2.2.3 因素间交互作用分析 各因素对果酒酒精得率影响的响应面曲线如图2。在Y模型中可知,AB、AD、BD、CD交互作用对响应值的影响不显著,因此只对AC、BC的交互作用进行分析。响应面曲线陡峭程度可反映因素之间交互影响大小,坡度越陡,影响越大,且等高线形状也可反映出各因素交互作用对响应值的影响,当等高线为椭圆时,说明交互作用显著[23]。根据图2可知,BC响应面曲线更为陡峭,其等高线形成椭圆且更为密集,表明酵母接种量和初始糖度交互作用对酒精度影响最为显著,与方差分析结果一致。

2.2.4 工艺优化及验证实验 通过Design-Expert V 8.0.6分析得到野樱桃果酒最优发酵条件:K2S2O5添加量80 mg/L,初始糖度19.4 °Bx,酵母接种量3.5%,发酵温度23.3 ℃,在此条件下果酒酒精度为10.96%vol。为验证模型可行性同时考虑实际操作性,设定最优发酵工艺参数:K2S2O5添加量80 mg/L,初始糖度19 °Bx,酵母接种量3.5%,发酵温度23 ℃,以此条件重复3次实验,得酒精度为10.8%vol。与理论预测值相差较小,表明该响应面回归模型具有可行性。

2.3 不同陈酿时间野樱桃果酒挥发性成分的分析比较

2.3.1 野樱桃果酒香气成分总离子流图及成分统计 利用GC-MS对在最优发酵条件下,对不同陈酿时间(10、12、14、16 d)野樱桃果酒挥发性物质进行检测分析,其总离子流色谱图如图3所示,野樱桃果酒香气成分保留时间主要集中在7.5～32.5 min,通过NIST11谱库检索分析,共鉴定出90种挥发性风味物质。采用峰面积归一化法可知鉴定出的化合物分别占总挥发成分总量的82.71%、93.80%、92.18%、91.02%。

2.3.2 主要挥发性风味物质分析 果酒香气成分是评价果酒品质的重要指标之一[8],其种类丰富,主要包括酯类、醇类、酸类等[24]。醇类赋予果酒优雅的香气[25],酯类赋予果酒浓郁的果香[26],对酒的主体香型有很大影响[27]。测定不同陈酿时间野樱桃果酒中主要香气成分及相对含量见表4。由表4可知,野樱桃果酒中香气物质主要有醇类(17种)、酯类(41种)、酸类(7种)、烃类(9种)、醛类(9种)。陈酿10 d野樱桃果酒香气成分共64种,醇类(占32.53%)相对含量最高,以7-十六-1-醇含量最高,其次为α-松油醇;陈酿12 d时果酒香气成分种类及含量均有所增加,共74种,其中酯类含量相对最高(35.848%),醇类含量次之(35.48%);陈酿14 d,果酒香气成分共有72种,醇类物质含量达到不同陈酿时间中最高,为38.36%,但酯类成分含量下降,仅为31.96%,不含有甲酸庚酯、乙酸己酯、乙酸苄酯、月桂酸甲酯以及10-十一烯酸乙酯等具有特殊香气的物质;陈酿16 d,果酒香气成分仅49种,且醇类和酯类物质含量最低,分别为30.29%、29.48%。

续表

根据肖作兵等[28]和张妮[29]的研究可知,苯甲醛、辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸己酯为樱桃果酒最重要的香气物质,其中苯甲醛[30]为樱桃的主要香气成分,使果酒具有特殊的苦杏仁味和焦糖味,由表4可知,苯甲醛随陈酿时间延长,相对含量从4.04%增加到6.330%;而辛酸乙酯(2.26%)、己酸乙酯(3.46%)以及乙酸己酯(0.17%)均在陈酿12 d野樱桃果酒中含量检出最高。且经检测发现,野樱桃果酒经陈酿12 d时酒精度为10.1%vol,酒精度变化不大。综合分析发现,野樱桃果酒陈酿12 d时,在保持其原有酒精度的同时更有利于保留樱桃清新的果香以及浓郁的酒香。

2.3.3 野樱桃果酒主成分分析 使用SPSS 22.0分析软件对不同陈酿时间野樱桃果酒中共有挥发性物质进行主成分提取,以确定其关键香气,最终结果见表5,主成分载荷矩阵见表6。由表5可知,共提出3个主成分,第一主成分贡献率51.040%,第二主成分贡献率29.129%,第三主成分贡献率19.803%,累计贡献率99.972%,因此,前3个主成分包含了41种共有挥发性风味物质绝大部分信息。

表5 提取3个主成分的方差解释

表6 主成分载荷矩阵

由表6可知,对第一主成分贡献较大的物质有兔耳醛、香叶醇、肉豆蔻酸、苯甲酸、正癸酸、(+)-2-蒈烯、正己酸、3-甲基苄醇;对第二主成分贡献较大的物质有己酸乙酯、辛酸、γ-松油烯、丁香酚;对第三主成分贡献较大的物质有9-十六碳烯酸乙酯、芳樟醇、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇、壬酸、2,3,4-三甲基-3-戊醇、辛酸甲酯。整体野樱桃果酒香气物质主要为酯类、醇类和酸类,这与张妮[29]研究一致。

为了进一步明确第一主成分和第二主成分中各风味物质所起作用的差异,现以第一主成分载荷矩阵为横坐标,第二主成分载荷矩阵为纵坐标作散点图,见图4。

图4 共有挥发性风味物质的主成分分析

如图4所示,根据各风味物质所处象限差异,第一主成分中8种风味物质对野樱桃果酒风味影响主要分为2类,位于一、四象限内。第一类有兔耳醛、香叶醇、肉豆蔻酸、苯甲酸、(+)-2-蒈烯、3-甲基苄醇;第二类有正癸酸、正己酸。第二主成分中4种风味物质也对野樱桃果酒风味的形成有影响作用,分别在一、二象限。第一类有己酸乙酯、γ-松油烯;第二类有辛酸、丁香酚。影响野樱桃果酒香气的主要成分位于第一主成分和第二主成分的正半轴处,即图4中右上角圈内的物质,依次为苯甲醛、兔耳醛、邻苯二甲酸丁基酯、油酸乙酯、苯甲酸、辛酸、肉豆蔻酸、2,3,4-三甲基-3-戊醇、顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇、芳樟醇、3-甲基苄醇、香叶醇、(+)-2-蒈烯、丁香酚、3,5-二叔丁基苯酚、棕榈酸异丙酯,其中香气贡献较大的依次为辛酸、己酸乙酯、丁香酚、苯甲醛、油酸乙酯、芳樟醇,这些物质赋予了野樱桃果酒特殊的果香、酒香、花香。

研究发现丁香酚、油酸乙酯及芳樟醇等为川西高原野樱桃果酒中的特有风味物质。丁香酚有强烈的丁香气息,具有抗菌、抗肿瘤、降血压、促进吸收等多种药理功能[31];油酸乙酯有花香和果香,黏性小且易被身体吸收,可作为类固醇等脂类药物的优良溶剂以及内注射制剂的载体和微乳剂[32];芳樟醇有百合花和铃兰花气息,具有抗菌、抗炎、镇静等作用[33],是金银花发挥药理作用的重要挥发性成分[34]。这些特有组分构成了川西高原野樱桃果酒所独有的风味特征,使其比普通樱桃果酒具有更好的口感以及较好的营养保健功效。

3 结论

本研究通过单因素和Box-Behnken响应面试验优化野樱桃果酒,确定最佳发酵工艺条件为:K2S2O5添加量80 mg/L,初始糖度19 °Bx,酵母接种量3.5%,发酵温度23 ℃,在此优化条件下,发酵15 d的野樱桃果酒酒精度为10.8%vol;通过HS-SPME结合GC-MS对川西高原野樱桃果酒中挥发性风味物质进行分析比较发现,陈酿12 d野樱桃果酒中香气成分种类更复杂,含量更丰富,其主要香气成分为醇类(35.480%)和酯类(35.848%),如苯甲醛、甲酸庚酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、十三酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、油酸乙酯、正己酸、辛酸、芳樟醇和7-十六-1-醇。在这些香气成分中,辛酸、己酸乙酯、丁香酚、苯甲醛、油酸乙酯和芳樟醇通过主成分分析表明对野樱桃果酒香气影响较大,且丁香酚、油酸乙酯和芳樟醇为野樱桃果酒特有风味物质,对川西高原野樱桃果酒的营养价值具有一定的营养保健功效。本研究为今后开发具有地域特色的川西高原野樱桃发酵产品奠定科学基础。