复苏植物牛耳草的快繁技术研究

方学兰，李粤丰，国朝胜，陈松，谭廷鸿

（铜仁学院，贵州铜仁 554300）

牛耳草，是苦苣苔科旋蒴苣苔属多生年草本植物，具有极强的抗旱和复苏特性，蕴藏丰富的耐旱基因资源，近年来已成为干旱逆境研究的模式植物[1-3]。其独特的脱水保护机制和复苏机能，通过基因工程手段可将特定功能基因用于改良和提高作物的抗旱特性[4-6]。由于自然生境中牛耳草结实率低，种子小、萌发能力差，其主要依靠无性生殖进行繁衍，因此室内繁殖困难，使得科研工作者在试验室难以获得持续稳定的试验材料。利用植物细胞的全能性和牛耳草的无性繁殖习性，通过组织培养和分株繁殖探究建立牛耳草的离体快繁技术，能解决牛耳草野外采集困难和室内繁殖不易存活的难题[7,8]。

1 植物材料

试验材料牛耳草采集于江西省宜黄县二都镇。选取根系完整的植株移植于通风、湿润的环境中，待其长出3～4 片新生叶，沿基部剪下无病虫害的成熟功能叶，作为组织培养和分株繁殖的外植体。

2 方法

2.1 组织培养

2.1.1 培养基成分。愈伤组织诱导、出芽和生根的培养基，以1/2 MS（Murashige & Skoog,Sigma）培养基为基底，添加3%蔗糖、0.75%琼脂粉，pH 值调为5.8，并分别添加不同浓度的6-BA 和NAA，设置激素浓度梯度及组合培养基进行试验。

2.1.2 外植体消毒及接种。先用自来水冲洗掉外植体表面的尘土及杂物，然后置于盛有蒸馏水的培养皿中，用75%的酒精棉涂拭外植体表面。随后将外植体带入超净工作台中，并放入0.1%的升汞溶液中浸泡3min，再用无菌水冲洗3～4 次，最后将外植体放在无菌滤纸上，吸干水分。用无菌手术刀将外植体切成1cm×1cm 的接种块，接种时将接种块背面接触培养基。

2.1.3 培养条件。于植物光照培养室中，设置培养温度为25±1℃，光照强度为35 μmoL/m2·s 的条件下进行连续光照培养。

2.1.4 炼苗与移植。待无菌苗长出2～3 片叶片且根系完整后，打开培养瓶盖子，适应外界环境的温度、空气及光照3～4d；然后将组培苗从培养瓶中完整取出，用流水冲洗掉根部的培养基，移栽到混合基质（珍珠岩：蛭石：泥炭土=1∶1∶3）中，等长出新生叶片后，再移植到土壤中。

2.1.5 数据统计分析。利用SPSS 20.0 中的Duncan 和LSD 方法对所得的数据进行方差分析及多重比较。利用以下公式进行数据统计：污染率=（污染苗数/接种苗数）×100%；无菌苗获得率=（获得无菌苗数/接种苗数）×100%；出芽率=（出芽外植体数/接种外植体数）×100%；增殖系数=形成的有效芽数/接种苗数；生根率=（生根外植体数/接种外植体数）×100%；移栽成活率=（移栽成活株数/移栽株数）×100%。

2.2 分株繁殖

2.2.1 叶片诱导新生植株的分株繁殖。取植株长势良好的牛耳草新生功能叶片，剪成1cm×1cm 方块后，均匀平放在土壤表面，保持叶片背面接触土壤，于植物培养室进行培养。控制室温为25±1℃，土壤湿度不低于85%，光照强度35μmol/m2·s，光暗周期16h/8h。培养6～8 周，带有完整根系和叶片的新生植株即可长出，随后进行移植扩繁。

2.2.2 匍匐茎的分株繁殖。在外界环境中，用松散湿润的土壤掩盖牛耳草的匍匐茎，保留茎的顶芽露出土面，待顶芽幼叶展开后，切断老叶与匍匐茎的连接点，继续培养数周，待顶芽长出新根，即获得完整的新生植株，随后进行移植扩繁。

3 结果与分析

3.1 牛耳草组织培养的适宜条件

通过不同浓度的6-BA 与NAA 进行组合探究，数据分析表明，以牛耳草成熟功能叶为外植体，其愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS+2.0 g/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；出芽诱导最适培养基为1/2 MS+3.0 g/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；生根诱导最适培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA。

图1 牛耳草组织培养过程

3.2 不同栽培基质对牛耳草组培苗移栽成活率的影响

牛耳草炼苗后移入珍珠岩∶蛭石∶泥炭土=1∶1∶3 的基质中，并进行遮荫保湿培养。统计数据表明，无菌苗移植成活率可达83.56%±2.76%，且植株生长良好。

3.3 分株繁殖效果

图2 牛耳草叶片诱导新生植株的分株繁殖

数据统计分析表明，牛耳草成熟功能叶诱导新生植株进行分株繁殖效果较好，成活率较高，可达80.36%±3.56%，而且诱导周期短，6～8 周即可实现规模化扩繁（图2）。匍匐茎的分株繁殖成功率较高，周期最短，只需3～4 周，但受限于匍匐茎的数量，故难以实现批量化扩繁。

4 结论

通过试验探究，确定了牛耳草组织培养的适宜条件，其愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS+2.0 g/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；出芽诱导最适培养基为1/2 MS+3.0 g/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；生根诱导最适培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA。同时通过叶片和匍匐茎诱导新生植株探索了牛耳草全新的分株繁殖技术，与组织培养技术相比，分株繁殖能显著缩短快繁周期。