SCD-1、LYSC在干眼症病人结膜上皮细胞及泪液中表达及意义

2020-12-09陈旭，申颖

内蒙古医科大学学报 2020年4期

陈旭，申颖

（1.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特 010059；2.内蒙古医科大学附属医院近视眼激光治疗中心）

干眼症（dry eye syndrome，DES）是一种常见的眼科疾病，由于任何原因造成眼泪质量、动力学异常改变，最终导致泪膜不稳定、眼表损害，临床上DES病人主要表现为眼睛干涩、易疲劳、有灼烧感或异物感、瘙痒、畏光、眼红、视疲劳等[1]。中国DES患病率约为21%～30%，经流行病学统计数据发现，DES发病病人受性别、年龄等因素的影响，研究发现女性病人多于男性病人，老年病人多于青年病人。DES发病原因众多，临床表现各异，发病机制较为复杂[2]。硬脂酰辅酶去饱和酶-1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD-1）是一种限速酶，其反应的主要产物油酸是人脂肪组织三酰基甘油的主要脂肪酸，与肥胖症和代谢综合征有关[3]。有学者研究发现，SCD-1敲除后小鼠表现出睑板腺异常[4]。溶菌酶C（lysozyme C，LYSC）是所有生物体不同组织中的多种溶菌酶之一，是细胞中的关键免疫蛋白，具有稳定的结构和较强的抑菌活性[5，6]。Piera等[7]研究表明DES病人泪液中LYSC水平明显低于正常人。关于SCD-1、LYSC与DES的相关研究在国内鲜有报道，因此本研究通过测定SCD-1、LYSC在DES病人的结膜上皮细胞以及所分泌泪液中的表达水平，以探究其在DES病人结膜上皮细胞以及泪液中的表达关系及其特殊意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机抽取在医院干眼门诊就诊的DES病人55例为DES组，其中男性21例，女性34例，年龄13～60岁，平均年龄38.52±7.36岁；同时选取于我院进行体检且眼科检查无异常的非妊娠健康人群50例作对照组，其中男性20例，女性30例，年龄15～60岁，平均年龄38.26±7.10岁。DES病人纳入标准均符合《干眼症临床诊断与治疗》中的诊断标准[8]。排除标准[9]：（1）近期眼部有炎症反应症状；（2）眼部曾做过手术或有眼角膜移植史；（3）近期一周使用过滴眼液；（4）合并免疫系统疾病。两组研究对象年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 样本采集与检测对照组在首次入院检查时采集样本，DES组病人分别在治疗前后采集样本。结膜上皮细胞采集：用干净刀片轻刮研究对象上睑结膜，放入冻存管中，置于-20℃冷冻冰箱保存，待测。泪液样本采集：将0.9%生理盐水注射液60μL滴入研究对象结膜囊内，让泪液与生理盐水混合充分后，分别收集左、右眼所分泌的泪液并置于离心管中，混匀后放入-20℃冷冻冰箱保存待测。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测SCD-1水平利用qRT-PCR技术检测SCD-1水平。用Trizol试剂盒（货号：RP2401，北京百泰克生物技术有限公司）提取总RNA。利用紫外分光光度计（UV-8000，上海精密仪表）检测RNA纯度。反转录试剂盒（货号：KL266，上海康朗生物科技有限公司）、PCR扩增试剂盒（货号：ZY-14806，上海泽叶生物科技有限公司）均严格按照说明书操作步骤执行，以GAPDH为内参基因。实验循环参数：提前预热至95℃，预变性30min；取出并降温至90℃，变性5s；迅速降温至58℃，退火20s；使温度保持在60℃，延伸45s，共40个循环。引物序列由生工生物工程公司合成，SCD-1上游引物：5’-AGATACACTCTGGTGCTCAACGC-3’，下游引物：5’-CAGGATGTTCTCCCGAGATTGA-3’；GAPDH上游引物：5’-GACTCCGCTAACATCAAATG-3’，下游引物：5’-GAGGGAGTTGTCATATTTCTC-3’。用2-Ct法计算SCD-1相对表达量。

1.2.3 微量快速比浊法测定LYSC含量利用微量快速比浊法测定LYSC含量[10]。LYSC测试盒、染色菌液制备、LYSC标准液制备及标准曲线绘制，均按照说明书操作步骤进行。LYSC测试盒（JN1255-BRE）购自北京百奥莱博科技有限公司，标准溶菌酶干粉（LM100406-10）购自上海联迈生物科技有限公司，酶标仪（RT-6000）购自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 临床指标检测

（1）泪膜破裂时间（break-up time，BUT）检测：在所有研究对象下睑结膜囊内涂抹20 g/L的荧光素钠溶液1μL，嘱受试者闭眼使荧光素钠溶液均匀的涂抹于角膜表层，通过裂隙灯在钴蓝光照射下仔细观察角膜，嘱观察对象瞬目后保持不动，观察在泪膜上产生的首个破裂点计为泪膜破裂时间。破膜时间<10 s则呈阳性结果，重复实验3次取其平均值；（2）基础泪液分泌试验（schirmer I test，SIT）：轻拨开受试者下眼睑，避免刺激其流泪，嘱受试者眼球上翻保持不动，在下眼睑中外1/3结膜囊内轻放入泪液分泌试纸，闭眼5 min后读取试纸湿润长度，结果以长度不足5 mm为干眼；（3）角膜荧光素染色（cornea fluorescein staining，CFS）：在研究对象的结膜囊内滴入20 g/L的荧光素钠溶液1μL，用0.9%生理盐水冲洗后，通过裂隙灯在钴蓝光照射下仔细观察角膜，以瞳孔中心为中点，将角膜划分为4个象限，根据染色情况对角膜破损程度进行评分（无染色记0分，离散点状染色记1分，密集点状染色记2分，片状染色记3分），共计0～12分。给予已确诊的DES病人0.1%玻璃酸钠滴眼液（德国URSAPHARM公司，进口药品注册证号H20150150）1滴/次，5～6次/天，2周后复查。

1.4 统计学处理

将所得数据用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验的统计学方法，以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 将DES组和对照组治疗前，在结膜上皮细胞及泪液中所含SCD-1、LYSC的水平进行比较

DES组病人结膜上皮细胞及泪液中所含SCD-1、LYSC的水平均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）（见表1）。

表1 DES组与对照组（治疗前）在结膜上皮细胞及泪液中SCD-1、LYSC水平比较(x±s，n)Tab.1 Comparison of SCD-1 and LYSC levels in conjunctival epithelial cells and tears between des group and control group（before treatment）（x±s，n）

2.2 对DES组病人治疗前后结膜上皮细胞及泪液中SCD-1、LYSC水平比较

DES组病人经治疗后结膜上皮细胞及泪液中SCD-1、LYSC水平均高于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）（见表2）。

表2 DES组病人治疗前后结膜上皮细胞及泪液中SCD-1、LYSC水平比较()Tab.2 Comparison of SCD-1 and LYSC levels in conjunctival epithelial cells and tears before and after treatment in DES group()

组别治疗前治疗后n 泪液LYSC（mg/mL）1.08±0.24 1.59±0.32 9.456 0.000 55 50 SCD-1 0.84±0.13 0.91±0.18 0.338 0.021 F P--结膜上皮细胞SCD-1 0.81±0.11 0.87±0.14 2.499 0.014 LYSC（mg/mL）8.15±1.24 10.26±1.48 8.104 0.000

2.2 DES组病人治疗前后临床指标变化

DES组病人经治疗后与治疗前相比，BUT延长，SIT值增加，CFS评分降低，差异有统计学意义（P<0.05）（见表3）。

表3 DES组病人治疗前后临床指标变化()Tab.3 Changes of clinical indexes in DES group before and after treatment()

组别治疗前治疗后n 55 55 t P--BUT（s）5.10±1.26 8.57±3.42 7.061 0.000 SIT（mm）4.68±1.22 5.24±1.49 2.157 0.033 CFS评分3.86±1.05 3.46±1.02 2.026 0.045

2.3 DES组病人SCD-1、LYSC水平与临床指标的相关性分析

DES组病人结膜上皮组织、泪液中所含SCD-1、LYSC的水平与BUT、SIT均呈正相关（P<0.05），与CFS评分均呈负相关（P<0.05）（见表4）。

表4 DES组病人结膜上皮组织中SCD-1、LYSC水平与临床指标的相关性Tab.4 Correlation between SCD-1、LYSC levels in conjunctival epithelium and clinical indexes in DES group

3 讨论

DES可引起病人眼睛红肿、充血，严重时会造成角结膜病变，影响视力。目前研究认为，DES核心机制是由泪液高渗透压和泪膜不稳定引起的[11]。泪液量减少是泪液渗透压增高的主要原因[12]，由于炎性介质破坏泪腺组织及潜在可逆的流动性神经分泌被阻断，导致泪液量减少[13]。炎症因子进入泪液，引起眼睑上皮细胞损坏，导致泪膜不稳定，促使泪液渗透压进一步升高，形成恶性循环。

SCD-1是一种含铁的同素酶，可催化饱和脂肪酸向单不饱和脂肪酸转化，在脂肪酸合成和代谢中起关键作用[14]。Tan等[15]研究发现，miR-199a-3p可能促进脂肪细胞增殖，通过下调SCD和改变脂质形成过程中的脂肪酸组成来抑制脂肪细胞分化。SCD-1也是癌症的潜在药物靶标[16]，在癌细胞中，SCD-1的活性上调利于癌细胞增殖。Angelucci等[17]研究发现，在与成纤维细胞共培养的肿瘤细胞中，膜流动性调节SCD-1表达上调，确立其在肿瘤细胞固有运动和驱动肿瘤细胞运动中的重要作用。泪液主要由脂质、蛋白质、无机盐和粘液组成[18]。泪液蛋白在保护眼部表面免受外部伤害方面起重要作用[19]，还能调节眼部伤口愈合，有助于维持泪液膜的稳定[20]。Inaba等[4]通过对SCD-1缺陷型（SCD-1 KO）小鼠泪液和眼组织的分析研究发现，SCD-1 KO小鼠泪腺脂质代谢基因表达降低，并且缺乏SCD-1会引起与脂质代谢基因表达相关的泪液量和粘蛋白水平代偿性增加，为治疗干眼症提供新策略。眼泪的产生与人类代谢综合症之间存在某种联系[21，22]。本研究结果显示，DES病人结膜上皮细胞和泪液中SCD-1水平低于正常对照组，治疗后SCD-1水平高于治疗前，提示SCD-1可能与泪液中的脂质含量存在某种关系，参与DES作用。

溶菌酶（LYS）是一种碱性蛋白酶，广泛存在于动植物各个组织及分泌物中[23]。在目前已知的6种LYS类型中，LYSC是研究最为广泛、深入的类型[24]。LYSC是由主泪腺腺泡分泌的具有抗炎、抑菌、抗氧化等特性的多功能链多肽[25]。陈彦等探究2型糖尿病合并干眼症病人LYS、表皮生长因子（EGF）和乳铁蛋白（LF）的水平变化，结果显示经玻璃酸钠滴眼液治疗后，病人泪液中LYS、EGF和LF水平均显著升高。有学者报道，LYS主要由嗜中性粒细胞分泌，当眼结膜受到炎症因子作用时，嗜中性粒细胞活性增加，刺激LYS分泌，使其水平升高，可作为指示机体防御功能的指标。本研究结果显示，DES病人结膜上皮细胞和泪液中LYSC水平低于正常对照组，治疗后LYSC水平高于治疗前，提示LYSC水平变化与DES的发生，发展有关。

本研究对DES病人治疗前后的临床指标进行比较，结果显示，与治疗前相比，治疗后BUT延长，SIT值增加，CFS评分降低。泪液中的蛋白质不仅起消毒杀菌作用，还提供脂质载体，稳定泪膜形态，保护滋养角膜及角膜上皮细胞。推测DES病人可能经长期炎症因子或者免疫因子侵蚀，眼表皮的免疫微环境稳态被破坏，临床症状加重，可以通过滴注人工泪液的方式减缓DES病症。利用Pearson分析DES患者结膜上皮组织及泪液中SCD-1、LYSC水平与临床指标的相关性，结果显示结膜上皮组织及泪液中SCD-1、LYSC水平SCD-1、LYSC水平与BUT、SIT均呈正相关，与CFS评分均呈负相关，提示SCD-1、LYSC可作为评价DES病人病情好坏的指标。