新型冠状病毒感染肺炎的实验诊断

陈福祥，罗清琼，徐北惠

（1.上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科，上海 200011；2.上海交通大学医学院检验系，上海 200025）

自2019 年12 月开始，新型冠状病毒（世界卫生组织将其命名为2019 novel coronavirus，2019-nCoV）感染机体引起的肺炎首先在武汉暴发，此后，全国各地多处有报告新病例。新型冠状病毒感染引起的疾病被世界卫生组织命名为COVID-19（corona virus disease 2019）；而在国际病毒分类委员会声明中，则将新型冠状病毒命名为“SARSCoV-2”（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）。目前，我国卫生健康委员（卫健委）发布的关于新型冠状病毒肺炎暂命名事宜的通知，决定将“新型冠状病毒感染的肺炎”暂命名为“新型冠状病毒肺炎”，简称“新冠肺炎”。

我国已将新冠肺炎纳入 《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并按甲类传染病管理。

新冠肺炎起病隐匿，根据患者初期的临床表现和影像学特征无法对其进行确诊。尽早确定新型冠状病毒感染与否不仅有助于患者及时得到规范化治疗，防止病情延误，更有助于及时切断传染源，控制疫情进一步扩散。因此，新型冠状病毒感染相关的实验检测至关重要。目前，相关的实验检测包括病毒本身或者其特异性组分和机体感染病毒后的反应性产物，检验项目多样、方法各异，具有不同的优缺点。本文将就此进行初步分析和评价。

病毒感染病原学确诊的依据

从送检标本中分离培养出完整的病毒或检测到其特异性组成成分（蛋白质或者核酸）是新型冠状病毒感染的直接证据和金标准。病毒分离培养因必须在生物安全三级实验室的生物安全柜内进行，且需报经国家卫健委批准，取得相应的资质后方能进行，限制了病毒分离培养在COVID-19 实验检测中的普遍应用。因此，目前针对新型冠状病毒感染的实验检测，主要是对其核酸进行检测。

一、核酸检测及结果判断

《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》 指出，疑似病例送检标本行实时荧光RTPCR 检测新型冠状病毒核酸阳性或基因测序，如结果与已知的新型冠状病毒高度同源，即可确诊为新型冠状病毒感染[1]。将新型冠状病毒的全基因组序列与其他物种的基因组序列进行比对，发现新型冠状病毒与菊头蝠携带的冠状病毒BtCoV/4991 高度同源（98.7%），但进化分析显示其含有区别于其他病原体的特异RNA 序列[2]，提示如果能在患者的样本中检测到该序列，则提示该患者为新型冠状病毒感染。实时荧光RT-PCR 检测的是新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab 和核衣壳蛋白2 个序列[3]。同一份送检标本的开放读码框1ab 和核衣壳蛋白序列检测结果同时阳性，该病例即可确认为新型冠状病毒感染；如果检测结果仅为单个靶标阳性，则需重新采样检测（可以是相同类型的标本，也可以是不同类型的标本），结果若仍为单个靶标阳性，可判定为阳性。另外，如果2 种标本的实时荧光RTPCR 同时出现单靶标阳性，也可判定为新型冠状病毒感染。

二、检测相关的影响因素

作为新型冠状病毒感染的确诊方法，核酸检测需避免出现“假阳性”和“假阴性”结果。“假阳性”通常由标本间交叉污染或实验室扩增产物的遗留污染所致，因此，要求实验人员严格按规范流程操作。另外，也可采取“3 个阴性样本随机放在临床样本中间，同时参与检测全过程”的策略来对实时荧光RT-PCR 检测结果进行质量控制。

样本采样部位不佳、采样量不足、采样过早或过晚、保存不当及检测试剂盒性能不佳等常导致“假阴性”结果。因此，需要规范采样人员的操作，并根据实际情况采集合适的标本[包括鼻和（或）口咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液、血液、眼结膜拭子或粪便等]。《新型冠状病毒防控方案》中对样本的采集和处理有详细的描述，故在此不再赘述。

另外，由于新型冠状病毒为RNA 病毒，易被外源性或细胞破坏后释放的RNA 酶降解，所以标本采集后应低温保存、运送，并尽快进行检测。此外，由于本次疫情发展迅猛，市场上现有的核酸检测试剂盒前期性能验证不完善，品牌之间的检测性能参差不齐。因此，当核酸检测结果为阴性但临床非常怀疑患者为新型冠状病毒感染时，建议多次采样，并采用多种试剂进行检测和验证。

病毒感染后机体反应性产物的检测

新型冠状病毒作为一种外源性的致病原入侵机体后，机体的免疫系统能迅速对其识别并产生免疫应答，从而反应性地出现免疫细胞亚群比例及活化状态的改变，并伴随细胞因子及特异性抗体的产生。另外，随着疾病的进展，与疾病相关的某些实验室指标也会反应性地升高。

一、免疫细胞亚群分析

“非典”疫情之后，大量研究成果显示，宿主免疫状态评估在严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）的诊断、治疗和发病机制研究中有着重要作用。在对急性期和恢复期SARS 病例的研究中发现，急性期患者的T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK 细胞）的数目明显低于正常人[4]；SARS 病毒可在患者外周单核/巨噬细胞内大量复制[5]，树突细胞在发病最初2 周数目减少，在恢复期缓慢恢复至正常值[6]。

研究报道，在COVID-19 患者发病早期，外周血白细胞总数正常或减少，但淋巴细胞计数显著减少。有研究发现，COVID-19 患者外周血CD4+及CD8+T 淋巴细胞计数显著下降，但活化细胞比例明显上升，表现为CD4+T 淋巴细胞中CCR4+CCR6+Th17 比例及CD8+T 淋巴细胞中穿孔素和(或)颗粒溶素表达增加，提示这些免疫细胞参与了机体的炎症反应[7-8]，但其具体的应答机制目前尚不清楚。

从国家卫建委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》和目前公布的临床研究结果来看，淋巴细胞总体数量下降与新型冠状病毒感染患者的病情进展相关，特别是与重症及死亡患者的病程特征间有很强的相关性。因此，结合以往治疗SARS 的经验[9-10]，对患者外周血标本中CD4+T淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞及其亚群甚至其他免疫细胞如巨噬细胞等的检测，将有助于COVID-19 的辅助诊断，并对新型冠状病毒感染患者的预后及治疗监测具有一定指导意义。

二、细胞因子检测

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子可以调节固有免疫和适应性免疫应答，但其作用是把“双刃剑”，适宜水平的细胞因子可以抑制病毒复制和传播，而过高水平的细胞因子则会加剧组织损伤。“细胞因子风暴”又称细胞因子释放综合征，即由于免疫系统过度激活导致大量促炎细胞因子急剧升高的现象[11]，可导致急性呼吸窘迫综合征和多脏器衰竭。

研究显示，季节性流感病毒甲型流感病毒感染的重症患者体内辅助性T 淋巴细胞1 和辅助性T 淋巴细胞17 的分泌水平更高，白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-12 等细胞因子是危重症的标志[12]。SARS 患者体内的“细胞因子风暴”主要涉及IL-1β、IL-6、IL-12、γ 干扰素、干扰素诱导蛋白10 及单核细胞趋化蛋白1 等，而中东呼吸综合征患者主要致病细胞因子为γ 干扰素、肿瘤坏死因子α、IL-15 和IL-17[13]。

在此次新型冠状病毒感染的肺炎疫情中，“细胞因子风暴”也成为导致重症和危重症COVID-19患者死亡的重要原因之一。研究表明，相对于非重症监护患者，重症监护患者的血浆中存在更高水平的IL-2、IL-7 以及肿瘤坏死因子α[14]；新型冠状病毒感染机体后迅速激活单核细胞、巨噬细胞和T 淋巴细胞，通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-6通路，形成炎症风暴，导致严重的肺部免疫损伤[15]；使用阻断IL-6 通路的药物“托珠单抗”后，可不同程度地改善重症患者呼吸功能氧合指数，使部分患者肺部病灶吸收好转[15]。因此，通过检测外周血中细胞因子水平的变化也可辅助判断COVID-19 患者的预后、监测病程，拮抗某些关键炎症细胞因子，还可以对疾病进行辅助治疗。

三、抗体检测

病毒感染后7 d 左右，机体可产生针对病毒的特异性抗体。因此，血液标本中特异性抗体的检测也可反映病毒感染的存在。抗体检测方法很多（免疫胶体金方法、酶联免疫吸附试验、化学发光测定等），目前已有部分厂家研发出针对新型冠状病毒IgG 和（或）IgM 的抗体检测试剂盒。前期，对70 例确诊患者血液样本进行检测研究后发现，IgG 的阳性率为77.14%，IgM 阳性率为35%[16]，关于血液样本抗体检测的评价，尚需要更多的临床研究加以佐证。但抗体检测无疑将成为除核酸检测外判断新型冠状病毒感染的另一有利手段。因为核酸检测虽然在确诊新型冠状病毒感染中具有不可替代的作用，但由于其操作繁琐、耗时长、对实验室和技术人员要求高，不适宜用于疑似患者和密切接触人群的快速筛查，而特异性抗体的检测恰可弥补这一缺陷，可实现快速、大规模、批量操作，且可降低医务人员在呼吸道样本采集过程中的暴露风险。

需要注意的是，由于从病毒进入机体到机体产生特异性抗体需要一段时间（窗口期）以及检测试剂盒的灵敏度不一致，抗体检测结果也可能出现“假阴性”的情况；另外，受血液标本中的某些干扰物质（如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等）的影响，抗体检测也可出现“假阳性”结果。因此，检测抗体时，通常需联合检测IgM和IgG，且建议多次检测并观察动态效价予以确认。

四、其他相关指标的检测

肌钙蛋白I 或肌钙蛋白T 是心肌损伤的特异性血清标志物，新型冠状病毒感染中度或重症患者因呼吸系统受损、氧合不足，从而导致心肌缺血性损伤释放肌钙蛋白I 或肌钙蛋白T。肌钙蛋白I 或肌钙蛋白T 的检测有助于判断新型冠状病毒感染患者的心肌损伤程度以及预后风险。D-二聚体是反映凝血功能的指标，也是肺栓塞的排除指标。新型冠状病毒感染重型病例多在1 周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征，因此，D-二聚体水平可反映病情进展。另外，重症肺炎会导致多器官衰竭，加重心脏负担，尤其对于有心脏基础疾病的患者，更容易发生心力衰竭（心衰）等事件。脑钠肽是诊断心衰的首选指标，可用于急性冠状动脉综合征的危险分级评估，是心脏功能的评估指标。检测脑钠肽，一方面有助于鉴别新型冠状病毒感染引发的呼吸困难与心衰引发的呼吸困难，另一方面可用于评估重症患者的病情进展。因此，在对疑似及确诊新型冠状病毒感染患者进行救治时，检测肌钙蛋白I 或肌钙蛋白T、D-二聚体和脑钠肽有助于判断病情及鉴别诊断，减少等待时间，提高救治效率。

此外，C 反应蛋白、红细胞沉降率和降钙素原等对新型冠状病毒感染也具有一定的辅助诊断价值。部分新型冠状病毒感染患者还可见丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶及肌红蛋白升高。

小 结

无论是判断患者的预后还是疫情防控的需要，尽早确诊新型冠状病毒感染都十分重要。核酸检测作为目前新型冠状病毒感染患者的实验诊断确诊方法之一，各种因素导致其对新型冠状病毒感染的检出率仅在30%～50%，因此，合理地联合其他项目检测将有助于疾病的诊断和鉴别诊断。抗体检测是一个较好的辅助筛查指标，其检测相对快速、灵活、便捷，但其试剂盒开发还需加快进程，以尽快投入临床应用。细胞因子、免疫细胞特别是淋巴细胞亚群和其他疾病相关指标的检测，有助于新型冠状病毒感染的疾病进程判断、疗效监测和预后评估。