牙龈卟啉单胞菌菌毛与消化道肿瘤关系研究

郑月月，李智涛，韩海芳，梁梦歌，高社干

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是口腔内数百种细菌之一，是一种高度厌氧的革兰氏阴性菌，与牙周病密切相关[1]。牙周病(periodontal disease,PD)是牙周组织的慢性疾病，包括牙龈炎和牙周炎。牙龈炎是牙齿周围软组织中最初的可逆性炎症病变，牙周炎是导致牙周组织破坏的多种因素共同作用结果，会导致不可逆骨吸收和牙齿脱落[2]。该细菌除引起口腔感染外，在冠心病、中风和糖尿病的发生中发挥作用[3]。

牙菌斑是牙齿表面的一种生物膜，在口腔中具有高度组织和整合微生物群落的功能。牙龈卟啉单胞菌是牙菌斑组成的一部分，使牙菌斑具有一整套重要毒性特征。牙龈卟啉单胞菌中含有大量致病因子，包括菌毛、半胱氨酸蛋白酶、血凝素和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，这些因子与宿主免疫系统的许多相互作用强烈支持了牙龈卟啉单胞菌作为病原体的毒力。其中，菌毛是牙龈下菌群定植的关键因素，因为菌毛能促进细菌对靶点的黏附和侵袭[4]。

近年来，越来越多的研究集中到Pg对相关肿瘤发生发展的影响上，随着研究深入，发现菌毛蛋白在与宿主相互作用和定植、逃避免疫防御、牙周组织破坏等方面发挥重要作用[5-6]，这能解释Pg是如何影响消化道肿瘤的。本文对Pg菌毛致病机制、免疫系统以及Pg与相关消化道肿瘤的关系进行综述。

1 牙龈菌毛致病机制及作用

1.1 菌毛

菌毛是位于细菌表面的丝状结构，可增强细菌与多种表面的黏附，如细胞基质、宿主细胞和其他细菌，并参与生物膜形成。菌毛是从细菌细胞外膜伸出3～25 μm、薄的、蛋白质表面附属物，这些结构藏匿在牙龈弧菌菌株中[7]。牙龈卟啉单胞菌在细胞表面有两种不同菌毛：一种是由菌毛基因(称为长菌毛或主菌毛)编码亚单位蛋白(称为菌毛或菌毛蛋白)组成；另外一种是由mfa1基因编码的亚单位Mfa蛋白组成，称为短菌毛、小菌毛或Mfa菌毛[8]。它们都调节细菌对各种分子和口腔基质的依赖性，对生物膜形成起重要作用。Hajieshengallis等[9]根据氨基酸和DNA序列，把fimA分为6种类型：fimAⅠ-fimAⅤ和Ⅰb型。Ikai等[10]报道成熟菌毛具有Mfa1蛋白，还含有Mfa2-5蛋白。Mfa2起锚定的作用，Mfa3与Mfa1、Mfa2、Mfa4、Mfa5在体外结合，作为结合蛋白与其他菌毛亚单位连接起来。Hall等[11]研究表明，Mfa1的C-末端结构域，影响下游菌毛蛋白的聚集和成熟。

1.2 短菌毛

Pg的Mfa1菌毛参与黏附，与口腔生物膜中的协同物种结合。Mfa1菌毛由5种蛋白质组成：构成菌毛顶端复合体结构成分的Mfa1、锚定Mfa2、Mfa3、Mfa4、Mfa5[12]。Mfa1的聚合与Mfa3-5无关，需要RgpA/B介导的蛋白水解过程。Mfa1的N-端和C-端都是聚合所需要的，而这些区域中潜在的破坏氨基酸取代的β链不损害Mfa1聚合[13]。恰恰相反，用N-端或C-端结构域中的带电残基替换疏水性氨基酸产生未能聚合的Mfa1蛋白[14]。Mfa3是Mfa1和其他辅助菌毛蛋白之间的衔接蛋白，Mfa1菌毛聚合依赖于N-末端和C-末端区域疏水性[10]。Hospental等[15]研究发现，在大肠杆菌的Ⅰ型和P型菌毛系统中，菌毛蛋白是缺乏β链的C末端保守不完全IgG折叠，该折叠形成一个疏水槽，与另外一个亚基上N-末端β链相互作用，从而形成二聚结构，两个末端之间相互作用产生菌毛结构的聚合主链。

Mfa1菌毛与人树突状细胞的DC-SIGN受体结合[14]。Zeituni等[16]报道Mfa1和DC-SIGN相互作用，有助于Pg进入树突状细胞，使Pg在树突状细胞内持续存在，导致树突状细胞成熟受阻，并刺激Th2效应反应，从而使炎症细胞因子水平降低。Hasegawa等[17]发现，mfa1、mfa2、mfa3、mfa4排列在一个操纵子中，mfa5是独立转录的。Mfa2位于菌毛的基部，起着锚定、修饰和伸长终止作用。Hasegawa等[18]报道，Mfa3定位于Mfa1菌毛末端部分，作为与宿主细胞和其他口腔细菌受体的配体而发挥作用。Shoji等[19]发现Mfa1、Mfa3和Mfa4通过信号肽酶Ⅱ的表达发生，被脂蛋白运输到细胞表面，在细胞表面被Rgp切割而产生成熟形式。Hasegawa等[14]报道，Mfa5含有血管性血友病因子a型结构域，通过Ⅸ型分泌系统(T9SS)转送到细胞表面。

1.3 长菌毛的其他成分

通过对PgfimA基因侧翼区域和典型模型检测的综合分析。下游ORF(open reading frame,ORF)，即ORF1、2、3、4，分别编码15、50、80和19 KDa蛋白，在每一种蛋白对应特异性抗体中，有两种针对50和80 kDa产物的抗体与纯化菌毛反应，被认为是与菌毛相关的次要成分。最近有报道3种ORF(FimC、FimD、FimE,分别命名为ORF2、3、4)编码与FimA蛋白相关的小组分[20]。FimC和FimD被认为是在FimA纤维上组装所必需的，而FimA上游的两个基因参与FimA表达的调控。此外，FimA的表达受FimA蛋白本身表达水平以及Rgp和Kgp的控制。有报道称，FimC、FimD和FimE突变体失去自身聚集能力，从突变体中纯化的长菌毛与口腔链球菌GAPDH以及纤维粘连蛋白和Ⅰ型胶原的结合率降低[17]。因此，FimC、FimD和FimE可能是与长菌毛相关的黏附性末端成分，而重组FimA蛋白表达各种结合活性，同时它被称为黏附分子。纯化的FimC和FimD与CXCR4相互作用，FimC和FimD与纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原结合，FimE不能与这些基质蛋白相互作用。这些研究结果表明，FimC、FimD、FimE在Pg的毒力和组装菌毛功能中起重要作用[21]。

1.4 fimA基因分型的致病机制

FimA由fimA基因编码，在Pg的染色体上以单拷贝形式出现[22]。中川等[23]证明与fimA基因Ⅱ型相对应的重组FimA蛋白比其他基因型FimA蛋白在动物模型中具有更强的黏附和侵袭人类上皮细胞的能力。对fimA各种基因型致病性进行实验，fimA基因型Ⅱ、Ⅰb和Ⅳ比fimA基因型Ⅰ和Ⅲ的菌株表现出更强的感染症状和炎症变化。另外，fimAⅠ型基因被Ⅱ型基因代替的突变体表现出较强的细菌黏附和侵袭能力。与此相反，用fimA基因Ⅰ型替换Ⅱ型导致侵袭黏附能力下降，Ⅱ型菌毛是毒力的关键决定因素。在慢性牙周炎中，fimAⅡ、fimAⅣ、fimAⅠb这3种基因型的Pg分离株比其他基因型的分离株更为普遍。有研究表明，fimAⅡ型基因在牙周炎和类风湿性关节炎患者中检出率较高，不同fimA基因型对牙周炎患者侵袭性致病潜力，Ⅱ型菌株更加普遍[24]。在健康成人中，fimA基因型Ⅰ的分离物在牙龈杆菌阳性中较为普遍，其次是Ⅴ型。从牙周炎患者口腔中采集的Pg株,经过临床培养的菌株fimA基因分型，基因型Ⅱ型、Ⅳ型和Ⅰb型与毒力有关[25]。

在运用PCR检测技术对fimA基因分型研究中，发现几种不同引物的PCR交叉反应呈现阳性。Enersen等[20]为了解释几种fimA引物PCR检测结果多重阳性反应菌株，用新的引物对选定的一些菌株进行测序，主要关注多重PCR反应阳性的菌株，证实fimA基因保守，在被检测的菌株中只有微小变异。除fimA基因变异外，其他特性可能与黏附和侵袭能力有关。这种结论得到了Inaba等[21]支持，他们报告了fimAⅡ型菌株的异源毒力，表明致病潜力和侵袭效率与细胞外分泌牙龈蛋白有关。大量实验和临床研究表明，fimA基因型可能是Pg致病力的决定性因素[26]。

1.5 菌毛在生物膜形成中的作用

生物膜的形成是一个复杂过程，涉及可逆性和不可逆性的细菌黏附、菌落形成、稳定三维结构形成和分散[27]。早期细菌的定植者，包括链球菌，附着在口腔表面，如唾液膜覆盖在牙齿表面。后来定植者附着在先前有机体上并组装成生物膜，是通过与其他细菌物种的共黏附介导的。长菌毛与细菌的细胞壁有很长的距离，表明它们是首先与其他细菌以及宿主细胞相互作用的细菌成分[8]。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是一种典型的糖酵解蛋白，参与供能，被认为是一种真核细胞和真菌保守的多功能管家蛋白。长菌毛和GAPDH之间的相互作用是链球菌表面Pg与牙龈假丝酵母菌的最初接触[28]，介导链球菌黏附的亚单位蛋白fimA的结合域定位于C末端区域。人类GAPDH也被证明与Pg长菌毛结合。

有报道称，短菌毛通过与链球菌SspA和SspB表面蛋白(抗原Ⅰ/Ⅱ家族)的黏附素受体相互作用介导与Pg之间的共黏附。SspA和B与短菌毛结合，比GAPDH与长菌毛结合亲和力高，从而提高短菌毛结合的亲和力[29]。长菌毛和短菌毛在生物膜形成中的作用不相同。利用缺陷突变体研究一组菌毛和牙龈蛋白(Rgp和Kgp)对同型生物膜形成的影响，结果表明，长菌毛促进生物膜的初始形成，进一步对生物膜的成熟起到抑制作用[30]。然而，短菌毛和Kgp对生物膜的发育具有抑制和调节作用[31]。另外，Rgp可能控制微生物菌落形态和生物量。有报道称，中间链球菌分泌的精氨酸脱氨酶可抑制fimA和mfa1的表达，同时也说明，这种精氨酸脱氨酶可以导致Pg生物膜的形成，因为Pg的自聚作用归因于FimA蛋白[32]。

1.6 长菌毛介导的免疫破坏

TLR信号通路与补体系统串扰，现在补体系统被认为在病原体标记和消除之外发挥作用。最近研究表明，Pg通过降低细胞免疫激活因子干扰素(IFN-γ)的水平来抑制细胞免疫[33]。Pg长菌毛与CR3相互作用，激活细胞外信号调节激酶1/2信号，抑制TLR2信号介导的IL-12生成[34]。另外，Pg的纯化菌毛与CR3的相互作用抑制放线菌等其他细菌LPS诱导小鼠巨噬细胞或人单核细胞产生IL-2和IFN-γ的能力。IL-2可调节IFN-γ的产生，也是参与病原体清除的关键细胞因子，IFN-γ是巨噬细胞杀菌活性的有效激活剂。所以，CR3激活与TLR-2途径和IL-12的抑制相互作用，促进了Pg在体内外的生存。长菌毛与TLR2相关受体CXCR4相互作用，抑制人单核细胞和小鼠巨噬细胞TLR2激活。另外，长菌毛诱导CXCR4介导的cAMP依赖性蛋白激酶A的激活，抑制TLR2诱导的NF-κB对Pg的激活。这些研究结果表明，长菌毛能使Pg在体内外具有抗清除能力。此外，OMZ314菌株的Ⅱ型菌毛能显著诱导细胞因子表达，尽管还没有明确发现，然而，不同类型的菌毛可能引起免疫破坏潜能不同。

2 Pg在消化道肿瘤中的作用机制

2.1 Pg与肿瘤发生的机制

Ahn等[35]的一项研究首次阐明消化道肿瘤死亡率与Pg的相关性，Pg在消化道肿瘤中可以作为一种有价值的微生物标志物。Pg除诱导肿瘤细胞侵袭和激活TLR(Toll样受体)外，还发现其他可能机制[36]。首先，Pg分泌的核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase,NDK)具有促进肿瘤发生作用。NDK抑制嘌呤能受体(purinergic receptor)的ATP激活，从而抑制上皮细胞IL-1β产生。IL-1β在诱导IFN-γ产生肿瘤抗原特异性CD8+T细胞中起重要作用，Pg分泌的NDK也能使肿瘤逃避免疫监视。NDK介导的ATP降解也抑制了依赖于P2X7受体ATP激活的细胞凋亡。此外，NDK对Pg热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)的磷酸化作用使牙龈上皮细胞具有抗凋亡表型，提示HSP27是抑制Pg致宿主细胞凋亡的关键分子。其次，Yilmaz等[38]注意到抑制上皮细胞凋亡是Pg的一个重要致癌作用，也是癌细胞的一个内在保护机制。激活JAk1/AKT/STAT3信号，增加Bcl2(抗凋亡)/Bax(促凋亡)比率，减少释放促凋亡因子细胞色素c，阻断caspase-9和caspase-3的激活都可以参与这一过程。另外，Pg调节microRNAs(miRNAs)的表达水平，由于Pg引起的miR-203的上调引起细胞因子信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)水平降低，进而抑制上皮细胞凋亡。由于SOCS3能与磷酸化JAK(janus kinase)受体结合，因此SOCS抑制JAK/STAT3信号。第三，Pg诱导B7-H1受体表达，该受体属于B7家族，在免疫反应中起着重要调节作用。另外，B7-H1受体介导的共刺激信号可引起活化的T细胞无能和凋亡，从而使肿瘤逃避免疫应答。第四，Pg引起的癌变也有助于诱导致癌物的代谢。例如，Pg将乙醇脱氢成乙醛，乙醛是一种致癌物的衍生物，能引起DNA损伤、上皮细胞突变和过度增殖[35]。慢性炎症与肿瘤的发生发展有密切的关系，炎症因子如IL-6的释放可以通过引起DNA低甲基化和启动子区高甲基化的异常变化来促进肿瘤的发生[37]。

2.2 Pg与口腔癌的关系

口腔由牙龈、舌背、舌侧、口腔黏膜等不同界面组成，这些组成有助于各种微生物定植和生长。2016年，全球口腔癌新发48，330例，死亡9，570例，被认为是全球第六大常见肿瘤[43]。在口腔癌中最常见的是口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)。Katz等[38]发现癌细胞中Pg的浓度高于口腔正常组织，认为Pg可导致口腔癌并成为上皮细胞转化为肿瘤的诱因。当Pg感染患病率为40.7%，Pg感染者与未感染者相比会使肿瘤和牙周病的发生率增加1.36倍。Kang等[39]的研究表明，头颈部肿瘤患者和健康成人的Pg感染率存在显著差异。此外，与未感染Pg的对照组相比，长期Pg感染组中细胞的CD44和CD133表达上调，这两种肿瘤干细胞标志物具有明显致瘤性。通过激活ERK1/2-ETS1、p38/HSP27和PAR2/NF-κB，Pg增加了基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloprotein-9, MMP-9)水平，从而促进OSCC细胞系的侵袭性。与Pg未感染细胞相比，感染Pg的细胞MMP-1、MMP-2、MMP-9和MMP-10的表达水平呈时间依赖性增加[40]。另外，活化的MMP-9已被证实能增加肿瘤细胞侵袭性。Ha等[41]研究表明，Pg通过上调IL-8和MMPs(特别是MMP-1和MMP-2)促进OSCC细胞的侵袭。Geng等[42]通过建立Pg攻击口腔上皮细胞23周的实验模型，发现长期接触Pg可加速细胞周期，促进细胞迁移和侵袭能力，在其他器官转移和增殖。与未感染Pg相比，慢性感染可通过血液途径促进体内转移。

2.3 Pg与食管癌的关系

在全球范围内，食管癌发病率居第八位，也是致死率第六位的肿瘤，我国中部是高发区[43]。食管癌早期诊断比较困难、发展迅速，死亡率比较高。这种肿瘤主要有两种组织学亚型：鳞状细胞癌和腺癌，鳞状细胞癌在发展中国家很常见，腺癌在发达国家比较常见[44]。通过检测ESCC患者Pg抗原和牙龈蛋白酶的表达强度，以及检测Pg特异性16SrDNA，均明显高于周围组织和正常对照组[37]。此外，肿瘤细胞的分化、ESCC(食管鳞状细胞癌)的远处转移、ESCC患者生存率等临床病理因素均与Pg呈正相关。表明Pg感染可能是ESCC的一个危险因素，而且还可以作为ESCC的预后指标。Pg抑制上皮细胞凋亡、促进肿瘤细胞免疫侵袭和诱导潜在致癌物质的代谢，都是ESCC发生发展重要因素。Gao等[45]首次报道宿主对Pg的免疫反应与ESCC细胞恶性增殖的关系，提示抗Pg抗体IgG和IgA可能作为ESCC的血清标志物，两者结合可以提高诊断率和改善预后。有报道称，食管癌的Pg感染率远高于贲门癌，而胃癌感染率几乎为零，这是由于缺乏酸适应[9]。

2.4 Pg与胰腺癌的关系

胰腺癌发病率较低，2007年至2013年的研究发现各期5 a生存率仅为8.2%。导致胰腺癌预后不佳的因素有很多，例如患者自身长期化疗抵抗力下降、缺乏诊断和预后的血清生物标志、缺乏个体化治疗的生物标志等[46]。多项研究表明，口腔微生物群和消化道微生物群之间存在重叠，部分原因是咀嚼和口腔卫生，如刷牙和使用牙线，这促进了多种传播途径失调。另外，口腔健康不良与胰腺癌发病率增加有关[47]。口腔微生物引起牙周炎的患者，胰腺癌的发生率比较高。一个欧洲研究团队发现，Pg ATCC 53978株血清抗体升高可使胰腺癌风险增加3倍[46]。最近研究表明，Pg启动了Toll样受体(toll-like receptors,TLR)信号通路，在动物模型中TLR的激活对胰腺癌的发生起着关键作用[34]。这被认为是Pg增加胰腺癌发生率的直接证据。另外，在胰腺癌患者中检测到高发的肿瘤抑制基因p53突变，说明p53基因异常是人类胰腺肿瘤发生的一个重要因素[48]。总之，Pg被认为是胰腺癌发生发展的生物标志，阐明Pg对胰腺癌的作用机制，加强实验研究，有望遏制胰腺癌高死亡率，缓解胰腺癌的现状。

2.5 Pg与结肠癌关系

口腔和结肠虽然解剖上距离远，但都是由不同微生物群高密度定植。研究表明，口腔细菌能传播到结肠。这在牙周炎等疾病中最为明显，在牙周炎中，Pg和具核梭杆菌表现出致病性[49]。在结肠中，这些细菌可以在复杂的生物膜环境中改变微生物群组成，导致肠道失调。这种破坏促进了免疫的异常和炎症反应，最终导致结直肠癌(colorectal cancer,CRC)肿瘤的发生。了解Pg与结肠癌之间相互作用的确切机制，有助于结肠癌预防和治疗。

虽然细菌从口腔转移到结肠的详细机制尚不清楚，但已经发现了两种可能的途径。第一个传播途径是通过连续吞咽。在慢性牙周炎中，口腔Pg和肠道微生物群通过几种机制保持相对独立，包括十二指肠中的胆汁酸和胃酸[50]。能够抵抗恶劣的胃酸性环境的口腔细菌可以通过这一途径维持其生存能力。这是Pg的一个特殊特征，因此有助于其迁移到结肠，从而改变结肠微生物群的组成和功能[51]。一个可能的因素是吞咽死亡的细菌成分，这些成分会上调细菌毒性因子的表达并诱发细胞毒性，这一概念被称为“营养性坏死毒性”。在一项体外研究中，至少10∶1的死菌与活菌比与牙周病原菌的感染显著相关，尤其是Pg[52]。与毒力因子相关的基因表达上调，包括牙龈蛋白酶基因rgpA、rgpB、kgp和菌毛fimA基因，也反映了上述效应。第二种传播途径是通过血液和全身循环(菌血症)传播到口腔外部位，包括关节、心脏和结肠。Pg和具核梭杆菌能够通过溃烂的牙龈袋侵入血流。Pg也可以在免疫细胞内生存，包括树突状细胞或巨噬细胞，随后传播到身体各部位。

Pg从口腔进入结肠后，能够降解结肠中的黏蛋白和细胞外基质，导致黏液层浸润并通过破坏上皮连接侵入黏膜。受干扰的黏膜生态系统促进蛋白水解病原体Pg的过度生长。例如，Pg产生半胱氨酸蛋白酶，称为“牙龈蛋白酶”(Kgp和Rgp)，对赖氨酸或精氨酸都有特异性，这些蛋白酶参与细菌生物膜的形成，随后刺激血管通透性和组织损伤[53]。此外，牙龈蛋白酶能够降解免疫因子，从而触发其生存的抗菌免疫反应。口腔细菌不断破坏结肠中的宿主蛋白质，导致慢性炎症状态，持续为微生物菌群产生营养物质，并促进结直肠癌的发生[54]。

口腔细菌的结肠生物膜可以通过合成致癌代谢物多胺进一步损害结肠。多胺是生物膜形成和微生物群存在的强制性因素，可诱导肿瘤异常增殖[55]。Pg在口腔中产生大量硫化氢(H2S)，H2S具有遗传毒性，可导致基因组不稳定或聚集的DNA突变剂。大量H2S生成酶在大肠癌中的表达上调，如胱硫醚-β-合成酶，它促进H2S的过度生成，进而通过诱导迁移、侵袭和增殖的内吞途径和刺激肿瘤血管生成而影响结肠癌的发展和扩散[56]。

本文主要对Pg毒力因子菌毛、Pg与消化系统肿瘤之间的致病机制进行讨论。Pg的fimA不同分型对人致病性存在一定差异，在健康人和牙周疾病患者中主要以fimAⅡ型检出率较高。fimAⅣ型在慢性牙周炎中的检测高于其他几型，其被认为是高致病性菌株，短菌毛的致病机制尚不清楚，有待进一步研究。Pg能使上皮细胞脱落和蛋白水解，Pg蛋白水解能力强，促进免疫反应，为生物膜形成创造了营养基础，同时抑制补体免疫等防御机制。Pg释放一些代谢物质会刺激牙周炎疾病发生。Pg能够合成各种致癌物质，如H2S等。消化系统肿瘤与Pg毒力因子之间是否有特异性机制，有待研究。总之，尚需要更多的研究来确定Pg与消化道肿瘤之间的关系。清除口腔Pg，降低Pg的感染率能否降低相关肿瘤的发病率是另一个富有挑战性的课题。