食管癌预后的生物标志物研究进展

闫锦阳，米优嘉，李婉莹，阮豪杰，耿聪聪，高社干

食管癌(esophageal cancer，EC)是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，其死亡率位居所有恶性肿瘤的第六位。2015年中国食管癌发病人数预计为47.79万人，同年有37.5万人死亡[1]。EC常见有鳞癌和腺癌两种亚型，西方主要常见腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)，而我国则以鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)为主[2]。从轻度不典型增生至重度不典型增生，再至原位癌，最后成为侵袭性肿瘤，EC的发生是多种因素参与形成的复杂结果。尽管提倡早发现、早切除和多手段综合治疗，但大多数患者仍会经历较长时间的无症状期和诊断困难的早期阶段，往往确诊时已发展至中晚期，导致出现高死亡率，伴随生活质量低下。目前基于常规病理变量，如肿瘤大小、分级和肿瘤分期，预测EC患者预后主要凭借医师丰富的临床经验[3]，且受到一定个体异质性的影响，故需要引用更加客观的指标帮助评估及管理患者[4]。一些生物标记物(液体活检、基因组学分子和蛋白质组学分子)可以较容易从组织和/或体液中分离出来，具有一定的临床应用价值[5]。以下回顾最新的研究进展进行综述。

1 与肿瘤增殖生长相关指标

细胞异常增殖是恶性肿瘤的典型特征。一些生物分子信号导致正常食管上皮细胞在分裂过程中发生异常，在肿瘤细胞增殖过程中扮演着重要角色。这些表达异常的分子和患者的预后紧密相连，有可能成为EC患者潜在的预后标志物。

Tang等[6]发现定位于11p15.5人染色体上的基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)是内质网膜上的Ca2+感应蛋白，表达水平与食管癌晚期分级呈正相关，刺激肿瘤细胞增殖生长，有助于帮助预后判断。有报道称沉默厚体1(dickkopf-1，DKK1)作为一种致癌基因，其分泌蛋白可通过与细胞表面Ⅱ型跨膜蛋白CKAP4结合激活PI3K-AKT通路，从而促进ESCC细胞增殖[7]。另外，富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11，PRR11)的过度表达提高肿瘤细胞的成瘤能力，其预后往往不佳[8]。相反，大脑表达X-连锁基因1(the brain expressed x-linked gene 1，BEX1)的启动子出现高度甲基化调节基因转录，其表达量明显与肿瘤体积大小相关，可作为肿瘤潜在抑制因子来预测患者的生存期[9]。

非编码RNA指不具有翻译蛋白质功能的RNA分子，包括Endo-siRNA、MicroRNAs、Piwi-interacting RNAs、Long noncoding RNAs、CircularRNAs等。MicroRNAs是一种长度含有18～25个核苷酸的内源性单链非编码RNA，通过抑制或者降解靶基因的表达起到调控作用，是参与细胞发育、维护内环境稳态的关键调控因子，不少研究认为MiRNA失调参与许多恶性肿瘤发生发展。Liu等[10]发现MiR-93-5p可通过外泌体进入肿瘤细胞，作用于PTEN基因，促进下游蛋白P21和Cyclin D1的过表达，导致受体细胞过度增殖。低表达的MiR-574-3p与食管癌患者肿瘤大小、淋巴结侵袭和预后密切相关，通过靶向作用于FAM3C和MAPK1蛋白调节PI3K/AKT及RAF/MEK/ERK两大信号转导通路，从而促进细胞凋亡，抑制移植肿瘤细胞生长[11]。过表达MiR-384通过抑制靶基因LIMK1，既阻断肿瘤细胞进入增殖活跃S期，又促进细胞发生凋亡，体外实验再次证明上调MiR-384可减缓肿瘤及淋巴结的生长速度和体积[12]。

长链非编码(long noncoding RNAs)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA，它们多在转录后发挥抑癌或促癌作用。目前公认P53是第一个被发现与肿瘤相关性最高的抑癌基因，不仅诱导细胞发生凋亡,还对细胞生长产生抑制效应[13]。沉默LncRNA AK001796可诱导细胞周期停滞在G0/G1期，进一步实验表明，LncRNA AK001796通过调节MDM2/P53信号通路促进肿瘤细胞增殖，可作为预后不良因素之一[14]。LncRNA 01617[15]、LncRNA CASC11均被发现在EC中高表达，加快细胞恶性增殖，促进肿瘤发生，且表达情况与患者预后紧密相关[16]。

2 与肿瘤浸润转移相关生物学指标

EC转移包含淋巴结转移、远处转移等，是医师及患者着重关注的疾病发展节点，预后结局往往不佳。因此需要寻找相关分子标志物对患者病情进行早期诊断和预后评估，进而辅助临床治疗，帮助受益。

在肿瘤转移进展过程中，上皮—间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是一个重要现象。上皮细胞失去细胞极性、失去与基底膜连接等上皮表型特征，获得间质表型，可导致迁移能力和侵袭性增强，加速肿瘤转移过程。EMT转变过程中重要的核心调控因子包含Snail、Zeb1、Twist等等，其中，正常细胞内Snail翻译水平受到泛素化修饰并被核蛋白酶降解[17]。而去泛素化酶OTUB1[18]、PSMD14[19]均可介导Snail去泛素化过程维持其蛋白质结构及功能稳定从而诱导EMT过程，促进EC肿瘤转移。此外，YAP(yes-associated protein)、CD44v9(CD44 variant 9)、IBSP(integrin binding sialoprotein)、 TCF21(transcription factor 21)也参与 EMT过程，起到正向或负向调控作用[20-23]。

Luo等[24]研究发现ADAM12-L属于ADAMs家族，可参与局部粘连激酶(focal adhesion kinase；FAK)的激活，通过FAK/c-Jun轴进一步增加其转录表达，二者之间形成一个正反馈回路，不断放大肿瘤细胞—基质相互作用信号，导致食管癌具有高度侵袭性表型，促进转移。

TCF7L2(transcription factor 7-like 2)和早期生长应答因子1(early growth response 1，EGR1)通过ERK1/2依赖的途径参与脂钙蛋白2(high level expression of lipocalin 2，LCN2)的转录激活，增强转移侵袭能力[25]。

非编码RNA不仅参与肿瘤生长的调控，在肿瘤侵袭、转移的过程中同样发挥重要调节作用。Zhang等[26]的研究发现位于染色体11q13.3上的MiR-548k过表达与患者总生存期差相关联，MiR-548k的特定区域可与ADAMTS1 MRNA的3′-UTR结合抑制其蛋白表达，游离VEGF-C的增加调节肿瘤微环境，促进肿瘤组织淋巴细胞生成和淋巴转移。相反，MiR-874-3p作为一种抑癌因子，作用于信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)抑制EC细胞发生迁移[27]。MiR-128-3p下调可靶向作用于ZEB1激活EMT过程，增加EC浸润转移风险[28]。在其启动子区域上含有CpG岛的3种基因出现高度甲基化可介导抑癌因子MiR-124表达降低[29]。ESCC患者血清MiR-1290水平显著升高与淋巴结转移有关联，可作为淋巴结转移的生物标志物[30]。

近些年，一些研究发现LncRNA CASC9、LncRNA DUXAP8、LncRNA 01296在食管癌组织中表达升高并促进体外肿瘤细胞浸润迁移的发展过程，生存分析提示预后不良[31-33]，需要更进一步探究功能并阐明其分子机制。

3 与肿瘤复发有关指标

改善预后结局的重要途径是根据病情给予评估，制定治疗方案后，通过随访检测，准确预测复发风险。传统临床成像和分期工具，如COM-Puter断层扫描、内镜和内镜超声检查在临床应用普遍，但灵敏度低也为诊疗带来难度。

在初诊和治疗期间尽早发现转移性肿瘤细胞对预后判断更具有优势。一项前瞻性研究报道外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)可作为独立预后指标。和骨髓播散肿瘤细胞(disseminated tumor cells，DTCs)相比，CTCs阳性状态是导致疾病复发和整体生存期缩短的重要独立因素[34]。针对淋巴结转移及远处转移状态不详的病人，评估CTCs状态更有临床价值，根据CTCs表达识别风险等级，可以进一步强化多学科综合治疗来降低死亡率。

成纤维细胞生长因子4(fibroblast growth factor 4，FGF4)是胚胎发育过程中的重要细胞因子，利用荧光原位杂交技术发现FGF4在食管癌组织中扩增。FGF4扩增与食管癌复发有关，是行根治性切除术后患者的独立预后指标。尤其针对Ⅲ期患者，FGF4扩增有助于风险分层，帮助医师进一步明确最佳治疗策略。在未来，FGF4扩增与临床TNM分期的结合可能作为准确预测ESCC患者5 a死亡和复发概率的预后模型[35]。

针对食管癌术后患者，Shinichi等[36]发现copine 5低表达组生存期较短，可成为监测肿瘤复发的一项重要独立指标，尤其是局部复发者。Hayato等[37]认为，黑色素瘤特异性抗原(preferentially expressed antigen of melanoma，PRAM)可能与其他基因协同作用促进食管癌的血源性传播，有望成为预测血源性复发的生物标志物。

4 与肿瘤耐药有关指标

肿瘤细胞对化疗药物出现耐药是导致临床治疗效果不理想的主要原因之一。某些分子在肿瘤耐药机制中发挥特殊作用，影响预后。

C-末端结合蛋白-2 (CtBP2)是一种与肿瘤发生、进展相关的转录抑制因子。CtBP2通过抑制促凋亡相关蛋白p53、Bax、activated caspase-3，增加Bcl-2抗凋亡蛋白水平来降低食管鳞癌细胞对化疗药物顺铂的作用敏感性[38]。但该研究仅针对单株细胞系，需要对其他类型EC细胞行进一步研究证实。

ALC1，又名染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因(chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like gene，CHD1L)，属于具有调控基因转录功能的SNF-2类家族，是该家族中唯一具有致癌作用的基因[39]。沉默该基因可抑制肿瘤糖酵解过程，抑制肿瘤细胞生长，增强顺铂杀伤肿瘤细胞毒性作用。而沉默丙酮酸脱氢酶复合体E1α亚单位(pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit，PDHA1)基因则可促进Warburg效应，增强EC细胞恶性行为和耐药性[40]。

5 与肿瘤免疫有关的标志物

随着肿瘤免疫相关理论的深入研究，基于免疫应答的新型疗法使肿瘤治疗发生革命性转变，对判断预后具有指导意义。除PD-1及CTLA-4外，人们逐渐探索发现了新的免疫检查点。

吲哚胺2，3-二加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO1)通过下调NK细胞受体及限制T细胞发挥功能，诱导食管癌发生免疫耐受反应。Yuki等对305例行食管癌切除术患者的肿瘤组织行免疫组织化学分析，发现阳性组总体存活率、无病生存率明显缩短，根据多因素模型IDO1阳性率与总死亡率升高呈显著相关(HR=1.75，P=0.036)[41]。IDO1独立于PD1/PDL-1途径，可联合其他靶点对治疗、预后起指导作用。

B7-H6是B7家族的新成员，与NK细胞表面的活化受体NKp30结合激活TNF和IFN介导的NK细胞杀伤肿瘤细胞[42]。91.72%ESCC组织中存在B7-H6蛋白表达，高表达患者生存差，可作为ESCC的独立预后标志物[43]。但该实验有一定的局限性，存在选择偏倚及混杂偏倚，需要进一步验证。

淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)存在于肿瘤浸润淋巴细胞、NK细胞、B细胞[44]，与PD-1同被认为是免疫抑制性受体[45]。一项研究报道称LAG-3表达与肿瘤临床分期显著相关，高表达预示患者的预后较差，尤其对于判断早期食管癌患者(T1-2、N0、Ⅰ～Ⅱ期)的临床预后具有重要意义[46]。

6 单一标志物预测生存期

易位融合基因AF1Q位于人体染色体1q21，可通过下游靶点WNT和STAT3促进肿瘤发生进展。对278例手术切除的EC标本进行研究发现接受新辅助治疗后AF1Q表达较高(P=0.0002)。根据Cox回归分析显示，在高表达患者中，疾病复发和疾病特异性死亡的风险要高出正常人1.5倍，是食管癌预后不良的独立预测指标[47]。

利用全血行基因组DNA提取检测，发现食管鳞癌患者染色体9p21上两个邻近的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制基因CDKN2A/2B发生遗传变异，rs1333049位点多态性与预后不良明显相关，CC基因型携带者总生存期明显缩短[CC基因型(34.5±8.9)个月VS CG+GG基因型(47.7±5.9)个月，P=0.03][48]。

瞬时受体电位V型(transient receptor potential vanilloid，TRPV2)作为膜蛋白也可通过调节细胞内Ca2+变化影响肿瘤发展进程。术前高表达TRPV2患者组，其5 a总生存率低于低表达组(59.5% VS 85.2%)，术后复发5 a生存率也明显低于低表达组(46.6% VS 0.0%)，且统计学均有意义[49]。

单一标志物的检测过程虽然较为简单、快速、高效、经济，但大多数单一肿瘤标志物敏感性或特异性偏低，存在漏诊和误诊的可能性，难以准确反映肿瘤的复杂性。

7 多种标志物组合预测生存期

肿瘤发生发展过程涉及步骤多、机制复杂，一套组合生物标志物可以更全面地评估患者预后。

Yu等[50]检测PLCE1、IKBα和P53这3种蛋白在癌组织中普遍高表达，随访发现3种表达均呈阳性则总生存期短，预后差(P=0.009)。3项联合检测建立的预后效能模型(AUC=0.624)可作为国际TNM分级评估预后(AUC=0.670)的完善与补充。

作为特殊的表观遗传修饰方式之一，含有赖氨酸残基的组蛋白可通过高度甲基化参与染色体调节、基因表达、细胞周期调控等，其异常表达可导致肿瘤发生。如H4K20me3、 H3K9me3、 H3K36me3分别与肿瘤浸润深度、淋巴结侵犯和分期密切相关。与单一指标相比，三者联合应用为评价ESCC患者预测预后指标提供证据[51]。

8 总结

肿瘤细胞合成或分解产生的一些生物活性物质，包括DNA片段、非编码RNA、蛋白质、酶、激素和代谢物等，均可作为生物标志物。不同于内镜组织病理学及影像学手段，检测生物标志物作为非侵入性评估方式，避免给患者带来不必要的疼痛及辐射。血浆肿瘤外泌体体外稳定、易于收集，携带囊泡物质含有大量生物学信息，特异度和敏感度优于传统的生物标志物。MiRNA、LncRNA、ctDNA、CTCs等作为新兴标志物也能够提供更多与肿瘤预后及治疗相关的信息。

然而目前的研究结果多为小规模试验，部分生物标记物的特异性和敏感性仍在争论中，比起单一检测某指标，更倾向于多种标志物联合应用进行评估，在今后需要大规模、前瞻性的临床试验数据予以支持。

随着对食管癌发展机制的研究，更多预后生物标志物会被发现，指导临床工作，使患者受益。