E3泛素连接酶RNF128在炎症和癌症中的作用和机制

赖维玲，谢 璐，刘雨霞，周 娟，王祥财，刘志平，

（1.赣南医学院2018级硕士研究生；2.赣南医学院基础医学院；3.赣南医学院炎症与免疫中心；4.赣南医学院第一附属医院肿瘤科，江西 赣州 341000）

泛素化是翻译后的一种修饰过程，不仅参与蛋白质的降解，还参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用和依赖不同泛素连接酶的细胞信号通路的传导［1］。泛素化是通过E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3 泛素连接酶与靶蛋白赖氨酸残基相互作用的系列酶联反应。在人类基因组中，E3泛素连接酶超过800 多种类型，是一庞大的蛋白家族体系［2］。根据结构域的不同，可将E3 泛素连接酶分为3 种不同的亚型：RING（Really Interesting New Gene）、U-box（UFD2 homology）、HECT（Homo-logous to the E6 associated protein C Terminus）和RBR（RING-between-RING）［3］。RNF128 属于E3 泛素连接酶RING亚型中的一员，含有PA（protease-associated）和RING（zinc-binding RING finger）两个结构域［4］，参与机体T 细胞失能、免疫耐受和细胞因子产生等多个生理过程［5］。有研究表明，RNF128与多种疾病如感染性疾病、代谢性疾病以及肿瘤的发生发展密切相关，本文就RNF128 的结构与作用及炎症和癌症中所起的作用和机制进行综述。

1 RNF128的结构

RNF128 又名GRAIL（Gene related to anergy in lymphocytes），是含有428 个氨基酸序列的Ⅰ型跨膜蛋白，定位于细胞内吞途径，属于E3 泛素连接酶RING 家族体系中的一员。运用多种不同的二级结构预测算法推测结果表明RNF128 由PA、跨膜区、卷曲螺旋区和RING 结构域组成。位于细胞外或者腔内的为PA 结构域，由四跨膜蛋白CD151 和CD81构成，起识别和捕获靶蛋白的作用。位于胞质内的为C3H2C3型锌指RING结构域，对靶蛋白起泛素化的作用［6］。依据与RNF128作用的赖氨酸部位不同，可分为与K48作用的底物，如T细胞抗原受体TCR（CD3）、CD40L、CD83、CD81、CD151、RhoGDI、Otubain 1、Otubain 1 ARF-1［6］，和与K63作用的底物［7］。

RNF128 的稳定性由Otubain 1 和其剪切异构体Otubain 1 ARF-1（otubain 1 alternative reading frame 1）调控［6］。有研究用酵母双杂交实验分析发现Otubain 1 和Otubain 1 ARF-1对RNF128的调控作用完全相反，Otubain 1 是卵巢肿瘤超家族中的泛素抑肽酶成员之一，通过与RNF128 的卷曲螺旋区相互作用促使RNF128 发生自主泛素化进而被蛋白酶体降解，而Otubain 1 ARF-1 是抑制RNF128 发生自主泛素化降解从而维持其稳定性［8］。

RNF128 作为E3 泛素连接酶家族成员的一员，除了具有泛素连接酶的一般特性和作用外，也具有其独特的作用。在正常机体中，RNF128 主要的作用有：（1）促进T 细胞失能；（2）促进免疫耐受［5］；（3）抑制细胞因子IL-2、IL-4 的产生［4］，抑制T 细胞的增殖［9］；（4）促进先天性抗病毒的免疫反应［7，10］；（5）参与细胞骨架的形成［11］；（6）抗高渗性（耐盐性）［12］。可见，RNF128 是重要的免疫调节因子，不仅参与先天性免疫反应，而且参与后天性免疫反应的过程。

2 RNF128与炎症性疾病

2.1 RNF128与病毒感染有研究发现RNF128是重要的先天性抗RNA 病毒和DNA 病毒的正向免疫调控分子。在体外实验中，用RNA 病毒仙台病毒（Sendai virus，SeV）和DNA 病毒1 型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1，HsV-1）感染小鼠腹腔的巨噬细胞和人类单核白血病细胞（Human monocytic leukemia）THP-1 后，无 论 是RNF128 的mRNA 还是RNF128 的蛋白质水平都高于未感染病毒的细胞，提示RNF128 对于先天性抗病毒免疫具有调节作用。同样的，动物体内实验研究发现，若将RNF128 基因敲除后，与WT 小鼠相比较，RNF128-/-小鼠对RNA 病毒水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VsV）和DNA 病毒HsV-1明显易感［7］。进一步的机制研究发现，RNF128通过PA 结构域与TBK1 的第63 位赖氨基酸相互作用，使TBK1 发生多聚泛素化后激活形成p-TBK1，下游信号分子IRF3 相继激活成为p-IRF3，激活形态的IRF3 入核诱导Ⅰ型干扰素IFN-β 产生，发挥抗RNA和DNA 病毒的先天性免疫作用［7，10］。综上，RNF128可通过促进TBK1 的泛素化，激活Ⅰ型干扰素信号通路发挥先天性抗病毒免疫反应。

LIN HT 等研究也发现RNF128 具有抗A 型流感病毒（Influenza A virus，IAV）的作用。较WT 小鼠相比，RNF128-/-小鼠感染IAV 后，出现生存率下降、肺部组织的病毒滴度更高、免疫细胞浸润更明显和更多的炎性细胞因子表达［13］。病毒的核蛋白（Viral nucleoprotein，NP）是病毒感染过程中表达最丰富的蛋白，在IVA整个生命周期中起着多种作用，包括病毒核糖核蛋白复合物（virus ribonucleoprotein complex，vRNP）核转运、病毒基因组的转录和复制，即NP 调控IVA 的增殖和复制［14］。体外实验发现，若细胞过表达RNF128，NP 表达下降，反之，NP 表达升高。研究结果表明RNF128 发挥抗病毒的一个作用机理为RNF128 可以同NP 相互作用，使其泛素化降解并阻止IAV 病毒复制，是IVA 的感染和复制的负向调控因子［13，15］。因此，RNF128通过促进病毒核蛋白泛素化降解而减轻A 型流感病毒的感染和病情进展。

2.2 RNF128 与细菌感染败血症是微生物感染导致的全身系统性炎症和免疫失调的一种疾病，可表现为发热（或体温过低）、心动过速、呼吸急促、血细胞数目的改变，甚至是感染性休克。AZIZ 等用小鼠盲肠结扎术诱导脓毒血症的模型实验中发现，小鼠脾脏的T 细胞RNF128 的mRNA 和蛋白的表达明显升高，IL-2 细胞因子表达减少，CD4+T 细胞的增殖受损。在体外细胞实验减少RNF128 的表达后IL-2表达升高，CD4+T 细胞的增殖能力也恢复正常，可减轻败血症造成的损害［16］。

SHIH 等用大肠杆菌的脂多糖注射给WT 和RNF128-/-小鼠诱导的败血症实验结果却表现为RNF128 缺陷的小鼠肺部中性粒细胞浸润、MMP-9和Caspase 3明显升高，炎症反应和多器官损害更严重。J774A，RAW264.7 细胞表达RNF128 缺失后，LPS 刺激细胞诱导促炎症细胞因子随之增多，说明RNF128 可减轻LPS 诱导的内毒素血症引起的巨噬细胞过度活化和多器官功能损害［17］。

由此可见，RNF128 在败血症发病过程中所起的作用还存在争议，一方面有可能因RNF128 抑制CD4+T 细胞的增殖减弱了机体抗感染的能力，加重了败血症的病理改变；另一方面RNF128 可减少促炎症细胞因子的产生、中性粒细胞的浸润和MMP-9、Caspase3 的表达水平，减轻败血症引发的多器官功能损伤。

SANDE 等报道结核分枝杆菌发生免疫逃逸也与RNF128 相关，结核分枝杆菌细胞壁的阿拉伯糖苷露糖脂（Mannose-capped lipoarabinomannan，LAM）可抑制CD4+T 细胞激活，是由于LAM 通过上调CD4+T 细胞表达的RNF128，抑制IL-2 的产生，继而导致CD4+T 细胞失能，结核分枝杆菌因此逃脱T 细胞识别和攻击，从而感染机体致病。RNF128 诱导CD4+T 细胞失能与Treg、细胞凋亡无关，也不影响CD3/TCR 和共刺激信号分子的表达［18］。因此，结核分枝杆菌细胞表面物质LAM是通过上调RNF128的表达，诱发CD4+T细胞失能而避免遭受免疫攻击。

2.3 RNF128 与寄生虫感染血吸虫病的病原体主要为曼氏血吸虫和日本血吸虫寄居在蜗牛体内，可通过穿透人类皮肤感染宿主。成熟的成虫生活在肠系膜或盆腔静脉中，雌虫产卵经血管腔进入肠腔，随粪便和尿液排出。虫卵通过血流循环停滞在肝脏和膀胱，引起炎性免疫反应（肉芽肿形成），导致肠道、肝脾或泌尿系统的疾病。依据临床病理分期可分为急性期、活动期和慢性感染期。有多个研究报道感染血吸虫的慢性阶段，在抗原的持续刺激下，Th2 细胞一直处于低反应性，且明显低于急性感染期。JUSTIN 等发现无论是体内还是体外实验，血吸虫感染小鼠和细胞株后Th2细胞处于低反应状态都是由于RNF128 的高表达引起的，且并非由于抗原递呈细胞（Antigen presenting cells，APCs）持续传递抑制信号所导致。用逆转录病毒转录SiRNA 抑制RNF128 的表达后，将促进Th2 细胞的增殖和分化，细胞因子IL-4 和IL-5、嗜酸性粒细胞、特异性免疫球蛋白IgE 也随之增多［19］。由此可以说明，在慢性血吸虫感染的过程中，RNF128 通过负向调控Th2细胞的反应性而加重病情变化。

RNF128 不仅与血吸虫感染有关，STEMPIN 等发现RNF128 还与克氏锥虫感染相关。予小鼠腹腔感染克氏锥虫的早期，脾脏CD4+T 细胞表达RNF128、PD-1 和CTLA-4 增多，导致T 细胞增殖受损，IL-2 和IFN-γ 细胞因子产生也减少，表现为对克氏锥虫的易感性增加。此外，该研究还发现RNF128 的表达受mTOR/Otubain-1 信号通路调控，IL-2 可激活mTOR 信号通路，诱导Otubain-1 表达，RNF128 发生自主泛素化降解，CTLA-4 的作用则是抑制mTOR 信号通路的激活而维持RNF128 的表达［20］。总之，RNF128 是通过抑制CD4+T 细胞增殖，减少IL-2 细胞因子的产生来增加机体对克氏锥虫的易感性。

2.4 RNF128 与炎症性肠病炎症性肠病（Inflammatory Bowel Diseases，IBD）包括克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC），由基因、环境和肠道菌群等多种复杂因素相互作用介导的一种慢性免疫性疾病。IBD 的具体病因和发病机制尚不明确，有报道称T 细胞失能与炎症性肠病的病理变化过程和耐药机理密切相关［21］，其中T细胞失能相关基因RNF128不仅与克罗恩病有关，与溃疡性结肠炎亦有关联。

MUKAI 等发现克罗恩病的患者与健康的志愿者相比，在外周血CD4+T 中，RNF128 的mRNA 和蛋白表达更低。动物体内实验中将高表达RNF128 的T 细胞静脉注射至小鼠体内后，用葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate，DSS）诱导的小鼠结肠炎发现，与对照组相比较，实验组小鼠体重下降更不明显、结肠长度更长和病理损害更轻，说明RNF128 对DSS 诱导的结肠炎具有保护作用。并通过miRNA微阵列分析发现，在小鼠肠黏膜中RNF128 的表达受miR-290-5p微小RNA 负向调控［22］。由此可知，在炎症性肠病的病理过程中，miRNA 负向调控RNF128的表达，可加重病理改变。

临床上，溃疡性结肠炎按疾病的严重程度可分为缓解期和急性加重期，若UC 患者的临床活动指数评分（Clinical activity index，CAI）≥6 分，便属于急性加重期。EGAWA 等用实时定量PCR 和蛋白印迹的方法检测发现，溃疡性结肠炎患者在缓解期RNF128的mRNA和蛋白质表达水平高于正常人，但在疾病的急性加重期RNF128 的表达无明显区别。若CAI评分增高的UC患者给予强的松激素和白细胞离心去除疗法（Centri fugal leukocyt apheresis，CFLA）治疗后，RNF128 的表达又会随之升高。流式细胞实验检测CD4+T细胞表面标志物发现，RNF128的表达与原始、记忆T 细胞和Treg 细胞的比例无关［23］。总之，RNF128 的上调在UC 患者病情维持在缓解期起着重要的作用，但其具体机制尚不明确，仍需进一步研究阐明。综上所述，RNF128 在不同炎症性疾病过程中发挥的作用总结如图1。

图1 RNF128与炎症性疾病之间的关系示意图

3 RNF128与恶性肿瘤疾病

泛素化几乎参与了细胞周期的调节、DNA 的损伤修复、基因的表达和信号转导等细胞生命活动的全过程［24］。正因泛素化的作用如此广泛，所以多种疾病的发生发展过程都与泛素化密切相关，其中肿瘤的形成也不例外。近来越来越多研究报道关于E3泛素连接酶与肿瘤之间的关系，800多种E3泛素连接酶中，由于E3泛素连接酶作用的特异性底物不同，其作为突变、表观遗传变化或转录改变去调节的结果，可分别导致减弱或加重癌基因和抑癌基因的降解，最终在不同肿瘤中所起的作用不相同［25］。现就RNF128（RING 型E3 泛素连接酶）在不同肿瘤中所起的作用机理进行总结（图2）。

图2 RNF128与恶性肿瘤疾病之间的关系示意图

3.1 RNF128 与黑色素瘤黑色素瘤属于皮肤恶性肿瘤的一种，发病主要与紫外线照射、基因突变和遗传等因素有关。WEI 等通过微阵列分析发现RNF128 在黑色素瘤组织中低表达，并通过RT-PCR和Western blot 实验方法验证了黑色素瘤组织较癌旁组织RNF128 的mRNA 和蛋白质表达低。细胞实验中，将黑色素瘤细胞表达的RNF128 下调后，RNF128 的底物CD44/皮动蛋白（Cortactin，CTTN）泛素化降解减少，激活Wnt/β-catenin 信号通路，导致CD44 和c-Myc 产物增多，诱导细胞的上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）和获得干细胞特性，从而增强了肿瘤细胞的侵袭和转移能力。临床实践同样也证实RNF128 下调的黑色素瘤病人总生存率（Overall survival rates，OS）降低，复发率增高［26］。可见，RNF128 可通过泛素化降解CD44/CTTN，抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活来阻止黑色素瘤的进一步发生发展。

3.2 RNF128 与尿路上皮细胞癌尿路上皮癌（Urothelial carcinoma，UC）包括肾盂、输尿管、膀胱和近尿道的上皮细胞肿瘤，主要的病因有吸烟、职业性接触芳香胺类、慢性血吸虫感染、放射治疗等。LEE等通过临床病例研究发现UC的病理分期、分化程度、淋巴结转移和血管侵袭与RNF128 密切相关，若RNF128 低表达，则肿瘤细胞的转移和侵袭性增高，UC 患者的预后差、生存率降低［27］。有报道称p53 在UC 的发生和发展过程中起着重要的作用［28］，RNF128可与p53的N端相互作用泛素化降解p53而调控其活性［29］，RNF128表达下降后通过促使p53失活导致UC 患者病情恶化，预后变差［27，30］。总之，RNF128通过正向调控p53的活性，对尿路上皮肿瘤的发生发展具有保护作用。

3.3 RNF128 与Barrett 食管炎/食管鳞癌Barrett食管炎的病理改变是正常的食管鳞状上皮被柱状上皮取代发生Barrett 化生的过程，为食管癌的癌前病变，可经低度异型性增生到高度异型性增生，最终演变成食管腺癌。RNF128 便参与了Barrett 食管炎恶变成食管腺癌的整个过程，RAY 等研究发现RNF128 存 在Iso1（Isoform 1 of RNF128）和Iso2（Isoform 2 of RNF128）两种亚型，并对食管癌变起着完全相反的作用。将Iso1和Iso2敲低或过表达的细胞实验发现，Iso1 可发生重度糖基化，抑制其与p53发生泛素化降解，从而维持突变型p53（野生型p53可诱导癌细胞凋亡，突变型p53诱导正常细胞癌变）的稳定性，促进炎症向癌症的进程，然而Iso2却可以降低突变型p53 的水平，阻断Barrett 食管细胞向食管腺癌细胞的癌变过程［31］。由此可知，不同亚型的RNF128通过其与底物p53发生的泛素化作用不同，分别起着促进和抑制肿瘤的恶型性变的不同作用。RNF128 在食管腺癌中的作用如前所述，但在食管鳞癌中的作用机理并非一致。GAO 等用细胞迁移侵袭实验（Transwell assays）发现，RNF128 在食管鳞癌细胞中过表达后，肿瘤细胞的迁移和侵袭性增强。在体内实验中，将过表达RNF128 的食管鳞癌细胞经尾静脉注射至裸鼠体内后，与对照组相比，该组小鼠体重下降更明显、肺部有更多更大的转移灶形成。进一步的机制研究发现，RNF128 与p53 相互作用，激活表皮生长因子受体（Epithelial growth factor receptor，EGFR）发生磷酸化，诱导其下游MAPK/MMP-2 信号通路激活，MMP-2 产物促进肿瘤的侵袭和转移［32］。因此，在食管鳞癌中RNF128与p53 相互作用激活EGFR/MAPK/MMP-2 信号通路，进而导致肿瘤细胞的侵袭和转移能力增强。

3.4 RNF128 与淋巴瘤HAYMAKER 等将EG-7淋巴瘤细胞（高度免疫原性肿瘤）皮下注射至WT 和RNF128-/-小鼠体内，发现RNF128-/-小鼠形成的肿瘤更小更轻，说明RNF128 缺陷后肿瘤的生长受到抑制。流式细胞术检测发现RNF128-/-小鼠脾脏中CD8+T 细胞和细胞因子IFN-γ 增多，且在EG-7 淋巴瘤动物模型中给予抗CD8α 抗体后，小鼠体内的肿瘤将增大，此外小鼠模型和淋巴瘤患者的CD8+T 细胞高表达RNF128 低表达IL-21R，进一步表明RNF128 可通过靶向调控IL-21R 的泛素化和降解从而使CD8+T 细胞失能，减弱CD8+T 细胞的细胞毒性作用，最终促进了淋巴瘤的发生发展。总而言之，在淋巴瘤中，RNF128通过负向调控CD8+T细胞抗肿瘤的反应性和活性而促进肿瘤的进展。

4 小结与展望

近年来关于RNF128 的大量探索和研究，让人们对RNF128 的作用以及在疾病过程中参与调控机理有了新的认识。RNF128 作为E3 泛素连接酶RING 家族的其中一员，不仅在炎症性疾病如：病毒、细菌、寄生虫感染和自身免疫性疾病过程中起着重要的作用，而且对恶性肿瘤疾病的发生发展起重要的调控作用（表1）。在病毒感染、IBD、黑色素瘤、尿路上皮癌这些疾病过程中主要为保护机体抑制疾病的进展与恶化，但在结核分枝杆菌感染、寄生虫感染、食管鳞癌和淋巴瘤起病过程中却起着加重病情变化损害机体的反向作用。虽然就目前而言，在有些疾病的病理变化过程中暂未涉及RNF128，或对当前疾病的作用机理尚未完全阐明，但相信通过未来对RNF128 的进一步深入研究，RNF128 的作用更为人们知晓，更能为临床治疗疾病提供新的诊疗思路。

表1 E3泛素连接酶RNF128在炎症和癌症中的作用机制以及产生的影响

续表1 E3泛素连接酶RNF128在炎症和癌症中的作用机制以及产生的影响

综上所述，在不同疾病的起病过程中，RNF128既有正向的抑制疾病进展的作用，亦有反向促进疾病恶化的影响。了解了RNF128 的结构特点和功能，以及在炎症和癌症疾病中发挥的作用机制，可以更好的为临床治疗各种疾病提供理论依据，尤其是肿瘤的治疗提供新的表面标志、新的治疗靶点和新的预后判断指标，为指导临床诊疗具有重要临床意义。