电针对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角PI3k/Akt信号通路的作用

薛 梦，孙亚兰，黄 诚

（1.赣南医学院2017级硕士研究生；2.赣南医学院2018级硕士研究生；3.赣南医学院基础医学院；4.赣南医学院疼痛医学研究所，江西 赣州 341000）

神经病理性疼痛是困扰全球患者的一种慢性疾病，其发病机制主要源由外周以及中枢神经系统的病变。大量研究表明，神经病理性疼痛患者伴有多种并发症，最常见的有焦虑、抑郁和睡眠障碍等，且这些病症具有复杂的双向关系［1-4］，对患者日常活动和健康状况均造成了重大的影响。据报道，神经病理性疼痛患者的生存质量明显低于普通人群以及未患有神经病理性疼痛者［2，5-7］，而且造成了社会负担加重和医疗保健成本增加［5-6，8］。在临床上也一直未找到治疗神经病理性疼痛的有效手段。电针在治疗神经病理性疼痛上具有不良反应少和疗效显著的特点，但其作用机制有待进一步阐明。研究发现，PI3k/Akt 信号通路对在背根神经节和脊髓的神经炎症的发生与神经可塑性的形成有着重要的作用［9-11］，而电针能够通过干预疼痛相关信号通路来抑制神经病理性疼痛的发生发展［12］。因此，电针是否能够通过影响PI3k/Akt信号通路来缓解神经病理性疼痛是本实验要探究的一个科学问题，这将为进一步寻找电针镇痛机制的潜在靶点打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物本实验选用的SPF 级成年雄性SD大鼠，体重约180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供［动物中心许可证号：SCXK（湘）：2016-0002］，所有动物严格遵守赣南医学院动物伦理委员会的要求。大鼠适应环境5 天后，按随机数字法将大鼠分为3组：Sham 组、SNI组和SNI+EA 组。Sham 组进行假手术操作，SNI 组对大鼠左下肢坐骨神经分支胫神经和腓总神经结扎剪断，保留腓肠神经。SNI+EA 组在SNI 手术后1 天对大鼠进行2 Hz电针治疗。饲养环境室温维持20 ℃～24 ℃左右，昼夜交替，水食自由，在大鼠电针治疗21天后取材。

1.2 主要仪器和试剂小型垂直电泳槽及转膜仪（美国Bio-Rad），化学发光成像系统AI600（美国GE），兔抗p-Akt IgG（1∶500，Cell Signaling Technology，#4060），兔抗AktIgG（1∶1 000，CellSignalingTechnology，#9272），兔抗p-PI3k IgG（1∶800，affinity，#3241），兔抗PI3k IgG（1∶1 000，Abcam，ab191606），小鼠抗Tubulin（1∶1 000，索莱宝，M1000140）。

1.3 神经病理性疼痛大鼠模型的制备用2%～3%浓度的异氟烷吸入麻醉大鼠后，在左下肢行胫神经和腓总神经行结扎剪断手术，保留腓肠神经。随后关闭手术切口，待大鼠完全苏醒后放回笼中，单笼饲养。而Sham组大鼠只暴露坐骨神经，不进行结扎剪断手术。

1.4 电针刺激将大鼠置于特制的大鼠固定笼中，使其后腿和尾巴裸露。在大鼠双下肢的足三里（ST36，胫骨前结节外侧5 mm）和三阴交（SP6，足内踝尖上3 mm）两个穴位插入不锈钢针（长4 mm，直径0.4 mm）。电针刺激参数为2 Hz，脉冲宽度为0.6 ms，刺激强度以1～2～3 mA 逐步增加，每个强度持续10 分钟。每隔一天对大鼠进行2 Hz EA 刺激，持续21 天。在2 Hz 电针刺激过程中，所有大鼠始终保持清醒状态。

1.5 Western blot检测在21天后，取大鼠左侧脊髓腰膨大（L4～L6）部分组织并－80 ℃冰冻保存，用RIPA 裂解液裂解脊髓组织，BCA 法测定蛋白浓度，把每个样品定量为30µg，然后加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液混匀，煮蛋白5分钟，进行蛋白变性。变性后的蛋白样品通过10%SDS-PAGE 胶电泳分离，电泳条件从40 V～100 V，并在PVDF 膜上进行恒流转膜。转膜结束后，室温下5%脱脂牛奶封闭1 小时，4 ℃过夜孵育一抗。第2 天，TBST 洗膜3 次，每次10 分钟，室温下孵育二抗2 小时，TBST 洗膜3 次，每次5 分钟，ECL 显色液以1∶50 配置，曝光，观察结果，对灰度值进行统计分析。

1.6 数据处理与统计分析应用Graphpad Prism 8.0 软件对数据进行分析，各组数据以均数±标准差（±s）表示，Western blot 结果采用单因素方差分析并随后进行Newman-Keuls post-hoc 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 Hz电针对SNI模型大鼠脊髓p-PI3k和PI3k蛋白表达的影响为了观察电针对SNI 大鼠脊髓PI3k的蛋白表达的作用，我们将大鼠分为3个组（每组n=3），实验结果如图1 所示，与Sham 组相比，SNI组大鼠脊髓中p-PI3k 和PI3k 的蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与SNI组相比，经过21 天2 Hz 电针治疗后，SNI+EA 组大鼠脊髓中p-PI3k 和PI3k 的蛋白表达明显下降（P＜0.05）。

2.2 2 Hz 电针对SNI 模型大鼠脊髓p-Akt 蛋白表达的影响为了观察电针对SNI 大鼠脊髓Akt 的蛋白表达的影响，我们将大鼠分为3 个组（每组n=4～6），实验结果如图2 所示，与Sham 组相比，造模后，SNI大鼠脊髓的p-Akt蛋白水平显著升高（P＜0.05），2 Hz 电针治疗后，SNI+EA 组大鼠脊髓的p-Akt 蛋白表达出现了明显下降（P＜0.05），而Akt蛋白表达无显著变化。

图1 2 Hz 电针对SNI模型大鼠脊髓PI3k蛋白表达的影响（n=3，±s）

图2 2 Hz 电针对SNI模型大鼠脊髓Akt蛋白表达的影响（n=4～6，±s）

3 讨论

文献报道，外周神经受到的伤害性刺激传递到脊髓，在脊髓背角整合后上传到脑部高级中枢引起疼痛行为的产生［13-14］。疼痛研究一直是国际学术界的热点问题，其中慢性疼痛对患者造成的生存负担引起了研究者的广泛关注，而神经病理性疼痛作为慢性疼痛类型之一，目前的治疗方法一直存在不良反应大的缺陷，因此急需寻找更有效的治疗手段。在中国，电针是治疗神经系统疾病的一种传统手段，该技术是将针灸穴位与现代科技有机相结合。本课题组前期工作发现电针能够缓解SNI大鼠的机械性痛敏，可通过干预背根神经节和脊髓小胶质细胞的激活，阻碍细胞炎症因子的释放以及一些相关痛信号通路分子的表达［15-19］。基于PI3k/Akt 信号通路参与了神经病理性疼痛的发生发展，这提示电针镇痛机制有可能是通过干预PI3k/Akt信号通路来发挥作用的，但有关电针镇痛的具体机制还需进一步探索。

实验表明，PI3k/Akt信号通路是构成细胞存活、增殖、凋亡以及自噬行为的重要生存通路［20-21］。在肿瘤细胞中，PI3k/Akt 信号通路的过度激活是引起其发生的重要途径，而PI3k 抑制剂可以阻止这种行为的发生，起到抗肿瘤的作用［22］。目前对于PI3k/Akt 信号通路在各种癌症（例如：胃癌、肝癌、乳腺癌等）的研究已被大量报道［23-25］。最近的研究发现，PI3k/Akt信号通路参与了神经病理性疼痛的脊髓中枢机制［11］。在CCI 模型大鼠中，PI3k/Akt 信号通路明显激活，机械痛阈值显著下降，而给予PI3k 抑制剂后能够控制这种变化的发生［11，26-27］。同时，PI3k/Akt 信号通路也参与了脊髓中枢敏化的形成，可影响突触可塑性的变化。进一步研究发现，PI3k/Akt信号通路的激活可诱导脊髓小胶质细胞的激活和炎症因子的释放增多，更大程度地促进疼痛行为的产生［11，27-30］。在背根神经节水平，调控PI3k/Akt信号通路能够影响神经病理性疼痛的发生发展进程［31］。

电针是在传统针灸针上增加电刺激脉冲，再通过施加到穴位的脉冲式电流来增强感觉输入。这样可以激活神经末梢并将产生的刺激信号传输到脊髓和大脑，刺激中枢神经系统产生特定的化学介质，以诱导其相关的生理作用［32］。在神经病理性疼痛临床治疗中，不同频率电针诱导的镇痛途径也不同，比如，低频电针主要通过调控脑内的内啡肽和脑啡肽而产生镇痛效果，而高频电针主要通过影响脑内的强啡肽来调控疼痛通路［33-34］。进一步研究发现，低频电针对神经病理性疼痛有着良好的治疗效果［35］。本实验选用2 Hz 电针对神经病理性疼痛进行研究也进一步佐证了其他相关实验结果。而且电针在脊髓水平可影响神经可塑性的形成和干扰中枢敏化的进展，这些也进一步得到实验证实［17，36］。在电针治疗神经病理性疼痛中，对神经炎症的调控也是影响其效果的重要因素。有实验表明，电针对一些炎症信号通路和细胞因子，例如HMGB1/TLR4、NF-κB 和JAK2/STAT3 信号通路以及IL-6、TNFα 和IL-1β 等均能起到抑制作用，致使炎性介质释放减弱，进而缓解疼痛［37-41］。而在对与疼痛密切相关的小胶质细胞激活状态的研究中发现，电针能够抑制背根神经节和脊髓小胶质细胞的激活［42-43］。这进一步说明电针可从多方面干预疼痛相关通路的信息传递以达到治疗神经病理性疼痛的效果。

综上所述，神经病理性疼痛的复杂病理生理学机制是其治疗难度大的重要原因。目前临床治疗神经病理性疼痛主要集中在阿片类药物、非甾体类抗炎药以及三环类抗抑郁药的应用，但这些药物存在诸多不良反应，如，镇静、恶心、呕吐、白细胞以及血小板减少等［13，44-46］。临床上也有联合应用辅助镇痛药与治疗药物，以求减少不良反应的产生。因此，寻求一种不良反应少且能对疼痛有着良好治疗效果的手段显得愈发重要。已有证据表明电针在神经病理性疼痛治疗方面有着良好的效果，而且电针也能明显缓解这些治疗药物所引起的不良反应。在神经病理性疼痛发生发展中，PI3k/Akt 信号通路是一条参与了脊髓中枢可塑性、胶质细胞激活以及炎症因子释放的重要通路。本实验也进一步证实，SNI 模型大鼠的PI3k 和Akt 蛋白分子的磷酸化水平明显上升，而给予2 Hz电针治疗后，PI3k和Akt蛋白分子的磷酸化水平显著下降。这说明2 Hz 电针缓解神经病理性疼痛可能是通过抑制PI3k/Akt信号通路来实现的。但是还需进一步应用抑制剂和激动剂来佐证电针的镇痛作用机制。