基于稀疏偏最小二乘回归分析白及抗氧化谱效关系

陈 丹，李红婷，谢国勇，秦民坚

(中国药科大学 中药学院，江苏 南京 211198)

白及为兰科植物白及(Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.)的干燥块茎，其味苦、甘、涩，性微寒，归肺、肝、胃经。除了具有消肿生肌，收敛止血的功效外[1]，白及自古便是美容良药，被誉为“美白仙子”。不论是元代《御药院方》中的七白膏还是现代各类美白护肤品，白及在美白方面发挥着重要的作用，而美白的作用机制之一是通过抗氧化清除机体代谢产生的自由基[2-3]。因此，研究白及的抗氧化作用对白及美白原理的探究具有重要意义。据报道，白及除了含有糖苷类，还有联苯类、联苄类、菲类及二氢菲类等化学成分[4]，这类结构的化合物具有较好的抗氧化效果[5-7]。现有研究中，白及抗氧化的相关研究较少[8-9]，起抗氧化作用的成分尚不明确。本研究建立12个批次白及的大孔树脂有效洗脱段的指纹图谱，并以稀疏偏最小二乘回归(Sparse partial least squares regression，SPLSR)方法建立模型，分析其与白及抗氧化的谱效关系，筛选白及抗氧化有效成分，旨在为白及美白机制的研究奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器

高效液相色谱仪(1290型，美国Agilent公司)，分析天平(MSE，北京赛多利斯天平有限公司)，Q-TOF LC/MS(Agilent 6520，美国Agilent公司)，数控超声波清洗器(KH5200DB，昆山禾创超声仪器有限公司)，高速万能粉碎机(QE-100，浙江屹立工贸有限公司)，高速控温离心机(TGL-16M，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，南京科尔仪器设备有限公司)，旋转蒸发仪(RE-2010，德国 Merck)，数字恒温水浴锅(HH-S4，金坛市医疗器械厂)，冷冻干燥机(LGJ-18S，北京松源华兴科技发展有限公司)，(超)纯水系统(NUII-10T，南京优普环保设备有限公司)，酶标仪(Epoch，Bio Tek Intsruments公司)，移液枪(10～200 μL/ 100～1000 μL，美国Thermofisher公司)。

1.2 试验试剂与药材

无水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)和乙腈(德国Merck)均为分析纯；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；DPPH(合肥博美生物科技有限责任公司，纯度≥97%)；ABTS(Sigma，纯度≥98%)；过硫酸钾(国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99.5%)；维生素C(Vitamin C，VC)(生工生物工程(上海)股份有限公司，纯度>99%)；VE(阿拉丁试剂有限公司，纯度>96%)；D101大孔树脂(天津海光化工有限公司)。

12批药材经中国药科大学秦民坚教授鉴定，为兰科植物白及(B.striata)的干燥块茎。样品信息如下：

表1 样品信息Table 1 Information of samples

2 试验方法

2.1 大孔树脂洗脱方法[10]

取100 g白及打粉，过60目筛，95%乙醇10倍量超声提取30 min，提取2次，抽滤后合并滤液。50℃旋蒸浓缩至40 mL左右转移至蒸发皿，继续50℃水浴浓缩至粘稠，最后冻干，得到白及醇提物的干浸膏。取100 g D101大孔树脂(含水率67.51%)湿法装柱于3 cm×70 cm层析柱。取3 g浸膏以60 mL无水乙醇溶解后加入240 mL纯水混匀后，以9000 r·min-1，25℃离心30 min，取上清液上样。以0.005～0.015 BV·min-1的流速反复吸附5～6次后，关阀静置过夜吸附。随后，用4 倍柱体积(BV)的水、30%、50%、70%、95%乙醇依次洗脱，洗脱流速控制在0.005～0.05 BV·min-1。收集各段洗脱液，50℃旋蒸浓缩至30 mL左右后转移至蒸发皿，继续50℃水浴浓缩至呈流浸膏状，随后冷冻干燥。

2.2 抗氧化试验

2.2.1 样品溶液的制备

称定水、30%、50%、70%、95%乙醇洗脱浸膏以及白及95%醇提物浸膏各5.00 mg，分别用水、30%、50%、70%以及95%乙醇溶解后容量瓶定容至5 mL，摇匀即得1 mg·mL-1样品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备

称定5.00 mg VC和VE，分别以纯水和95%乙醇溶解、容量瓶定容至5 mL，摇匀即得1 mg·mL-1对照品溶液。

2.2.3 DPPH溶液的制备

称取1.25 mg DPPH，以无水乙醇溶解，转移至25 mL棕色容量瓶中定容、摇匀得到0.05 mg·mL-1DPPH溶液，溶液现配现用。

2.2.4 ABTS+·溶液的制备

称取19.20 mg ABTS和3.31 mg过硫酸钾K2S2O8，分别以水溶解，棕色容量瓶定容至5 mL，配成7.00 mmol·L-1ABTS溶液和2.45 mmol·L-1K2S2O8溶液。将二者混合、摇匀，室温避光静置12 h，形成绿色的ABTS+·母液。使用前将其用无水乙醇稀释30倍，即得ABTS+·溶液。

2.2.5 DPPH清除试验

将样品溶液稀释成5个浓度梯度，分别取50 μL于EP管中，加入250 μL DPPH溶液，摇匀。室温避光静置30 min后在517 nm处测定吸光值3次，取平均值，VC和VE做阳性对照。每个样品平行3次试验。根据不同浓度下的DPPH清除率计算半抑制浓度IC50。

DPPH·清除率(%)= [1-(A样品- A空白)/A对照] × 100%[11]

其中，A样品为50 μL样品溶液加入250 μL DPPH溶液避光反应30 min后的吸光度，A空白为50 μL样品溶液加入250 μL DPPH溶剂无水乙醇避光反应30 min后的吸光度，A对照为50 μL样品溶剂加入250 μL DPPH溶液避光反应30 min后的吸光度。

2.2.6 ABTS 清除试验

将样品溶液稀释成5个浓度梯度，分别取50 μL于EP管中，加入250 μL ABTS+·溶液，摇匀。室温避光静置20 min后在752 nm处测定吸光值3次，取平均值，VC和VE做阳性对照。每个样品平行3次试验。根据不同浓度下的ABTS+·清除率计算半抑制浓度IC50。

ABTS+·清除率(%)= [1-(A样品- A空白)/A对照] × 100%[12]

其中，A样品为50 μL样品溶液加入250 μL ABTS+·溶液避光反应30 min后的吸光度，A空白为50 μL样品溶液加入250 μL ABTS+·溶剂无水乙醇避光反应30 min后的吸光度，A对照为50 μL样品溶剂加入250 μL ABTS+·溶液避光反应30 min后的吸光度。

2.3 HPLC指纹图谱及MS/MS条件

2.3.1 供试品溶液的制备

精密称取12批白及大孔树脂70%乙醇洗脱段的干浸膏各1.00 mg，分别加入70%乙醇溶液溶解并各自定容于1 mL的容量瓶中，得到1 mg·mL-1的溶液，再以0.22 μm的微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

2.3.2 HPLC色谱条件

汉邦C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(B)-水(A)梯度洗脱(0～15 min，18%～30%B；15～20 min，30%～34%B；20～28 min，34%～39%B；28～38 min，39%～45%B；38～42 min，45%～60%B；42～46 min，60%～95%B；46～50 min，95%B)；柱温：25℃；检测波长：270 nm；进样量：10 μL；流速：1 mL·min-1。

2.3.3 MS/MS条件

电喷雾离子化正离子模式；一级质谱扫描范围100～1000 m/z；雾化气压力40 psi；毛细管压力4000 V；干燥气流速10 L·min-1；干燥气温度350℃；碰撞压力25 V；锥孔压力40 V。

2.4 数据处理和统计分析

利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012生成指纹图谱；R软件3.6.2进行谱效分析建模；Microsoft Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19.0进行数据处理分析。

3 结果与分析

3.1 大孔树脂分段效果

各段洗脱物对DPPH和ABTS自由基的清除能力如图1所示。70%乙醇洗脱段对DPPH(IC50= 126.611 μg·mL-1)和ABTS(IC50= 16.319 μg·mL-1)自由基清除效果在各洗脱段中均为最佳，远优于树脂洗脱前的总提物清除效果(DPPH IC50= 2 270.965 μg·mL-1，ABTS IC50= 1 226.480 μg·mL-1)，其清除ABTS自由基的能力甚至优于VE(IC50= 26.096 μg·mL-1)，略逊色于VC(IC50= 12.527 μg·mL-1)。

图1 大孔树脂不同洗脱段的抗氧化效果Fig. 1 Antioxidant efficiency of different macroporous resin eluent fractions of B. striata

3.2 抗氧化效果

IC50作为评价抗氧化效果的指标，其值越小，表明清除效果越好。如表2所示，白及12个批次的70%乙醇洗脱段对DPPH、ABTS自由基表现出较好的清除效果，尤其是ABTS试验，所有样品批次的IC50均低于VE，略高于VC。

表2 12批次白及70%乙醇洗脱段DPPH、ABTS清除效果Table 2 DPPH and ABTS scavenging efficiency of 70% ethanol elution fractions of 12 batches of B. striata

3.3 HPLC指纹图谱

应用指纹图谱评价系统时，将样品S01设为参照图谱，中位数生成对照图谱，时间窗宽度为0.1。在经过多点校正、全峰匹配、生成对照R后，得到12批样品HPLC色谱叠加图如图2A所示；共得到27个共有峰，见图2B。计算相似度，结果如表3所示。12批次白及70%乙醇洗脱段HPLC色谱相似度范围为0.896～0.996，相似度结果较好。

最后进行方法学考察，共有峰的峰面积RSD均小于5%，精密度、稳定性、重复性良好。

图2 12批次白及70%乙醇洗脱段指纹图谱及共有峰Fig. 2 HPLC fingerprint and common peaks of 70%ethanol elution fractions of 12 batches of B. striata注：A. 12批次白及70%乙醇洗脱段指纹图谱；B. 12批次白及70%乙醇洗脱段共有峰

3.3 谱效分析结果

以12批次白及70%乙醇洗脱段指纹图谱的27个共有峰为自变量，分别以12批次白及70%乙醇洗脱段的DPPH和ABTS的IC50值为因变量进行稀疏偏最小二乘回归建模。

DPPH稀疏偏最小二乘回归模型为：

Y=-1.588X2-1.857X3-3.463X4-3.445X5+6.583X6-0.387X7-2.861X12-3.446X13-3.258X16-2.131X17-5.016X18+2.070X21+2.041X23-1.680X24-0.297X25

该模型的预测精度为

R2=0.991 7，RMSE=1.835 6，RPE=0.015 6

ABTS稀疏偏最小二乘回归模型为：

Y=-0.473X2+0.194X3+0.433X4+0.464X5+1.568X6-0.143X7-0.700X8-0.176X9-0.163X10-0.591X11-0.296X13-0.383X14-0.282X15-0.046X16-0.084X18-0.212X19-0.874X20-0.079X21+0.181X22-0.155X23+0.700X25+0.203X26-0.466X27

该模型的预测精度为：

R2=0.999 9，RMSE=0.004 5，RPE=0.000 2

各峰回归系数的绝对值大小表征对抗氧化效果的贡献程度，绝对值越大，峰的贡献程度越大。而因变量Y表示的是抗氧化效果的IC50值，所以Y值越小，抗氧化效果越好。故回归系数为负值的峰对抗氧化效果起促进作用，而回归系数为正值的峰对抗氧化效果起抑制作用。在DPPH的稀疏偏最小二乘回归模型中，X6，X21，X23抑制了DPPH抗氧化效果，其余峰起促进作用，促进效果依次为X18>X4>X13>X5>X16>X12>X17>X3>X24>X2>X7>X25。在ABTS的稀疏偏最小二乘回归模型中，X3，X4，X5，X6，X22，X25和X26对ABTS抗氧化效果起抑制作用，其余峰起促进作用，促进效果依次为X20>X8>X11>X2>X27>X14>X13>X15>X19>X9>X10>X23>X7>X18>X21>X16。

两模型的复测定系数R2均大于0.99，表明预测效果很好，且均方根误差RMSE和相对预测误差RPE的值都较小，说明预测精度较高。

图3 白及总离子流图及色谱图Fig.3 Total ion chromatogram and chromatogram of B. striata注：A. 白及总提物总离子流图；B. 白及总提物色谱图；C. 白及70%乙醇洗脱段色谱图

综合考虑峰的回归系数即峰的贡献程度以及峰面积的大小，选择对抗氧化效果影响相对较大的峰4、8、12、13、15、16进行MS/MS初步鉴定，鉴定结果如表3所示。

表3 有效峰MS/MS鉴定结果Table 3 Identification of effective peaks by MS/MS

4 讨论

偏最小二乘回归作为数据集探索性分析的有力工具，综合了多元线性回归、典型相关分析和主成分分析这三种分析方法，不仅克服了多自变量多重共线性的问题，还可以在样本量远小于自变量的情况下运用[23]。但是PLSR在拟合模型时会包含全部变量特征，当变量较多时，模型往往存在大量无关变量，使得响应变量缺乏解释能力。SPLSR的提出正是为了解决这一问题。通过在偏最小二乘算法中施加一个变量选择的过程，来扣除无关变量，简化模型[24]。近年来，SPLSR在科学研究中已经得到了广泛的应用[25-27]。

在该研究中，白及经过大孔树脂梯度洗脱分成了水、30%、50%、70%、95%乙醇洗脱段，其中70%乙醇洗脱段的DPPH和ABTS自由基清除效果最好。在此基础上，获得12批白及的70%乙醇洗脱段样品。随后，将12批样品进行DPPH和ABTS自由基清除试验，并通过HPLC检测。12批样品表现出了较好的抗氧化效果。分别以DPPH和ABTS自由基清除效果为药效指标，以12批样品生成的指纹图谱所获得的27个共有峰为自变量进行谱效分析。在选择分析方法时，由于自变量具有严重的相关性和多重共线性，且自变量个数大于样本量，所以选择了SPLSR进行谱效分析建模。参考郭婷婷[24]的SPLSR代码拟合出了DPPH和ABTS的药效模型。模型结果表明，白及的抗氧化效果不是单一化合物的作用，而是多个化合物协同作用的结果。其不仅仅含有促进抗氧化效果的化合物，也含有抑制抗氧化效果的化合物。此外，化合物含量对抗氧化效果有较大影响，虽然有些化合物的单位值(回归系数)在影响白及抗氧化效果的排名中可能并不突出，但是含量的优势也能使其成为主要有效成分，故以DPPH为指标时，峰4、12、13、16为主要药效峰，以ABTS为指标时，峰8、13、15为主要药效峰。从回归方程中可以看出峰2、7、13、16、18为DPPH和ABTS法共有药效峰，数量并不多，说明白及中清除两种自由基的化合物有较大差异，白及经大孔树脂洗脱后清除DPPH的效果提高了18倍而清除ABTS的效果却提高了75倍也从侧面印证了这一点。峰4、8、12、13、15、16经MS/MS初步鉴定为Lusianthridin，3,7-二羟基-2,4-二甲氧基菲，3-[(4-羟苯基)甲基]-4-甲氧基-9,10-二氢菲-2,7-二醇，Bletillatin D，Blestrianol A，3,3'-二羟基-2-(4-羟苄基)-5-甲氧基联苄，这些化合物属于菲类，二氢菲类，联苯类或联苄类，虽然属于不同类型的化合物，但是他们的结构中均含有苯环及羟基，故推测白及的抗氧化作用可能与酚羟基有关。其中峰13(Bletillatin D)与DPPH和ABTS自由基清除效果均有较好的相关性，是一个潜在的抗氧化剂。