正交试验法优化康定鼠尾草中迷迭香酸提取工艺

王 秀，张玉佩，吴小可，吴 楠，王卫东，梅丽娟，陶燕铎，杨小兵，于瑞涛*

(1. 中国科学院藏药研究重点实验室，青海省藏药研究重点实验室，中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2. 中国科学院大学，北京 100049；3. 东莞金美济药业有限公司，广东 东莞 523808)

康定鼠尾草(SalviaprattiiHemsl.)属唇形科(Labiatae)鼠尾草属(S. Linn.)植物，产于四川西部和西北部、青海省南部等地区，早在几千年前该属种植物就成为重要的药用植物[1]。鼠尾草属植物全世界有1000 种，我国有83 种，青海省有3 种，分别为甘西鼠尾草、黏毛鼠尾草和康定鼠尾草[2-3]。鼠尾草主要含萜类、酚酸类、黄酮类、丹参酮类、挥发油、多糖等成分[4-7]。具有活血祛瘀、调经止痛及清热安神等功效[1]。据报道鼠尾草对大鼠高原缺氧性肺、心、肝、脾、肾组织损伤均有明显的预防和保护作用[8]，鼠尾草酚能下调人脐静脉内皮细胞(HUVEC)黏附淋巴细胞的能力[9]等。迷迭香酸是一类水溶性多酚类化合物[10]，是鼠尾草属植物中的主要化学成分，迷迭香酸及其衍生物具有抗炎症、抗抑郁、抗氧化、抗肿瘤、抗微生物及减轻过敏性鼻炎、哮喘症状，减弱T细胞受体介导的信号传导，减缓阿尔茨海默病的发展等生理作用，在制药、食品及化妆品领域很有价值[11]。在改善睡眠、提高记忆力、维持葡萄糖平衡、减缓淀粉糊精样变、抑制肠道病毒、减轻睾丸损伤、治疗不孕不育等方面也有特殊药理作用[12]。本研究以康定鼠尾草全草为原料，采用超声波提取方法，以乙醇提取液浓度、提取时间、料液比、提取次数为考察因素，利用单因素结合L9(34)试验考察康定鼠尾草中迷迭香酸的提取工艺，为迷迭香酸提取物的工业化生产提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 试验仪器

高效液相色谱仪为Agilent Technologies 1260 Ⅱ(安捷伦科技有限公司)；100S型超声波清洗机(深圳市洁迈超声清洗设备有限公司)；upt-Ⅱ-100L型超纯水机(四川优普超纯科技有限公司)；FA2004型电子天平(常州科源电子仪器有限公司)。

1.2 材料与试剂

康定鼠尾草2019年8月采自青海省玉树，迷迭香酸标准品购自阿拉丁公司(生产批号：H1828073)，甲醇、无水乙醇均为分析纯。

2 试验方法

2.1 迷迭香酸标准品溶液的配制

准确称量迷迭香酸标准品0.001 2 g，用甲醇定容至10 mL。制成浓度为0.012 mg/mL的标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

准确称量康定鼠尾草粉末1.014 0 g于具塞锥形瓶中，加入60%乙醇30 mL，室温下40 kHz超声提取30 min，0.5 μL滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Reprosil Gold 120 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：5-95%乙腈-0.2%酸水(H3PO4)；紫外检测波长：254 nm；流速：1 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。标准品和供试品溶液的HPLC色谱图见图1所示。

2.4 单因素试验

通过单因素试验选出对康定鼠尾草中迷迭香酸提取具有显著影响的因素，并确定其试验水平。考察不同乙醇浓度、提取时间、料液比对康定鼠尾草中迷迭香酸提取的影响。各水平的选取参照迟晓峰[13]的方法并根据实际情况做了一定调整。考察的各个因素水平见表1。

图1 标准品与供试品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of standard and sample注：A：标准品； B：康定鼠尾草样品； 1：迷迭香酸

表1 单因素试验各因素水平表

2.4.1 乙醇浓度对提取效果的影响

以料液比为1∶30，40 kHz超声30 min，室温，提取次数为1次的条件下，考察不同乙醇浓度对迷迭香酸提取的影响。

2.4.2 提取时间对提取效果的影响

以料液比为1∶30，乙醇浓度为80%，40 kHz超声，室温，提取次数为1 次的条件下，考察不同的提取时间对迷迭香酸提取的影响。

2.4.3 料液比对提取效果的影响

以乙醇浓度为80%，40 kHz超声20 min，室温，提取次数为1次的条件下，考察不同的料液比对迷迭香酸提取的影响。

2.5 正交试验分析

根据单因素初筛试验结果及正交设计助手分析结果，确定对试验影响较大的因素和较好的水平，再加入提取次数因素，每个因素三个水平进行试验，采用SPSS Statistics17.0[14]软件进行分析。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验结果

3.1.1 乙醇浓度对迷迭香酸提取的影响

以料液比为1∶30(g∶mL)，40 kHz超声30 min，室温，提取次数为1次的条件下，考察不同乙醇浓度对迷迭香酸提取的影响。

表2 乙醇浓度单因素试验结果Table 2 Single factor experimental results of ethanol concentration

由表2可以看出，随着乙醇浓度的增加，迷迭香酸的提取量逐渐增加。当乙醇浓度到达80%时提取量呈现最大值后呈下降趋势。这可能是由于乙醇浓度超过适宜乙醇浓度会增加其他物质的溶出，降低迷迭香酸的相对含量，而且提高了投料成本，所以乙醇浓度选择80%。

3.1.2 提取时间对迷迭香酸提取的影响

以料液比为1∶30(g∶mL)，乙醇浓度为80%，室温，提取次数为1次的条件下，考察不同的提取时间对迷迭香酸提取的影响。

表3 提取时间单因素试验结果Table 3 Single factor experimental results of extraction time

由表3可以看出，随着提取时间增长，迷迭香酸提取量呈微弱的波动，为了节约时间成本，所以提取时间选择20 min、30 min、40 min。

3.1.3 料液比对迷迭香酸提取的影响

以乙醇浓度为80%，室温超声20 min，提取次数为1 次的条件下，考察不同的料液比对迷迭香酸提取的影响。

表4 料液比单因素试验结果Table 4 Single factor results of material liquid ratio

由表4可以看出，随着料液比的降低，迷迭香酸提取量呈微弱的波动，为了节约溶剂成本及将来工业化生产需要，因此选择料液比1∶8(g∶mL)，1∶11(g∶mL)，1∶14(g∶mL)。

3.2 正交试验结果

根据单因素初筛结果，分别以乙醇浓度、料液比、提取时间为因素，再加入提取次数因素(提取1次、提取2次、提取3次)，每个因素三个水平进行试验，因素水平见表5。

表5 正交试验因素水平表Table 5 The results of orthogonal test

用正交设计助手软件进行正交试验直观分析，结果如表6所示。

表6 正交试验直观分析结果Table 6 Visual analysis results of orthogonal test

由表6可以看出，康定鼠尾草中迷迭香酸最优工艺为A2B2C3D3，即乙醇浓度为80%、提取时间为30 min、料液比为1∶14(g∶mL)，提取次数为3次。提取次数对迷迭香酸的提取影响最大，乙醇浓度对提取影响最小。

根据单因素初筛试验结果及正交设计助手分析结果，分别确定提取时间、料液比、提取次数三个因素，将乙醇浓度项设为空列，借助SPSS Statistics17.0进行方差分析。

表7 方差分析结果(主体间效应的检验)Table 7 Results of analysis of variance (main effect)

由方差分析可知，影响因素中提取次数对提取迷迭香酸具有显著性影响，而料液比对其的影响较小(表7)。因素的主次关系是：提取次数>提取时间>料液比。

试验结果表明，从3 个因素中选择最好的水平，得到的最佳组合为B2C3D3，即提取时间为30 min，提取次数为3次，料液比为1∶14(g∶mL)。

4 结论

本试验以康定鼠尾草全草为原料，对迷迭香酸进行了超声提取工艺优化研究。采用单因素和L9(34)正交分析法对乙醇浓度，提取时间，料液比，提取次数四个因素进行优化。利用正交设计助手软件与SPSS Statistics17.0软件相结合的分析方法，通过直观分析可知，四个因素的主次关系为提取次数>提取时间>料液比>乙醇浓度。乙醇浓度因素在正交分析时极差值最小，因此在利用方差分析时将乙醇浓度设为空白列。但在单因素试验中，乙醇浓度在80%时迷迭香酸含量最高。在方差分析时，提取时间为30 min时，提取次数为3 次、料液比为1∶14(g∶mL)时迷迭香酸含量最高。综上所述，提取鼠尾草中迷迭香酸最优工艺为A2B2C3D3，即乙醇浓度为80%、提取时间为30 min、料液比为1∶14(g∶mL)，重复提取次数为3 次。在此条件下迷迭香酸提取效果最佳，迷迭香酸含量可达9.85 mg/g。通过康定鼠尾草中迷迭香酸提取工艺的研究，为迷迭香酸提取物的工业化生产提供了参考。