雏鸡源金黄色葡萄球菌分离及生物学特性鉴定

张召兴，李佩国，张海龙，陈 玥，李蕴玉，张香斋，贾青辉

(1.河北科技师范学院动物科技学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066604；2.河北旅游职业学院畜牧兽医系，河北 承德 067000)

1 材料与方法

1.1 病料来源 唐山地区某养鸡场中16日龄病死的海兰褐雏鸡，无菌采集病死雏鸡的肝脏、关节渗出液等病料组织进行细菌分离鉴定。

1.2 主要试剂与仪器 普通营养培养基、营养肉汤菌,均购自北京路桥生物技术有限责任公司；甘露醇氯化钠琼脂培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；Raid ID 32 STREP 阳性菌鉴定试条，购自Bio-Merieuxsa公司；DL-2 000 Marker，购自北京中生瑞泰科技有限公司；2×TaqMarker Mix，购自北京康为世纪生物科技有限公司。ATB自动化微生物生化鉴定系统由法国生物梅里埃股份有限公司生产；梯度PCR仪由德国Eppendorf 公司生产；隔水式恒温培养箱由上海一恒科技仪器有限公司生产；7%脱纤绵羊血培养基由本实验室提供。

1.3 试验动物 健康1日龄海兰褐雏鸡70只，购自秦皇岛市金牧种鸡场，饲养至16日龄进行试验。

1.4 分离培养与鉴定 无菌采集病死雏鸡的肝脏、关节渗出液等病料组织接种于7%绵羊脱纤血培养基上，37 ℃恒温培养12～18 h，挑取单个优势菌落接种于甘露醇氯化钠鉴别培养基上，37 ℃恒温培养12～18 h。挑取单个菌落分别接种于普通培养基和营养肉汤中进行纯化培养，取纯化培养的分离菌株进行染色镜检。

1.5 生化试验鉴定 按照说明书将纯化培养的分离菌调整菌液浓度为2个麦氏浊度，接种于Raid ID 32 STREP 阳性菌鉴定试条中，37 ℃恒温培养24～48 h，用ATB自动化微生物生化鉴定系统进行生化特性鉴定。

1.6 细菌16S rRNA的PCR鉴定 参考文献[6]设计细菌通用16S rRNA基因序列引物：5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用水煮法提取分离菌株的基因组DNA，进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为50 μL：2×TaqMix 25 μL,上、下游引物各2 μL,DNA模板3 μL，ddH2O 18 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶检测其目的条带，分离菌株的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序，测序结果与GenBank数据库中登录基因序列进行同源性比较与分析。

1.7 致病性试验 取纯化培养的分离菌株培养至对数期计数，调整菌液浓度。将60只16日龄健康雏鸡分为6组，每组10只，2～6组每只雏鸡通过腹腔注射攻毒0.2 mL，浓度分别为1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/mL和1.0×108CFU/mL；1组为对照组给予等量的生理盐水，攻毒12 h后，观察7 d，记录其发病情况和死亡情况。用寇氏改良法计算分离菌株的半数致死量(LD50)。

1.8 药敏试验 参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的标准K-B纸片法进行试验操作和结果判断。

1.9 多重耐药基因的PCR检测 参考文献[5]设计葡萄球菌的多重耐药基因cfr、fexA和fexB引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的分离菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。分离菌株的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序，测序结果与GenBank数据库中登录基因序列进行同源性比较与分析。

表1 多重耐药基因的引物序列

2 结果

2.1 细菌的分离培养 分离菌株在7%脱纤兔血培养基长出了光滑的、边缘整齐的菌落，形成透明的溶血环，呈现β溶血；在甘露醇氯化钠琼脂培养基上长出圆形的、边缘整齐的浅黄色菌落；在普通培养基上生长出圆形的、边缘整齐的白色菌落，长时间培养变成金黄色的菌落；革兰染色镜检，可见单个短链和成堆的葡萄串状排列的阳性球菌(见中插彩版图1)。

2.2 细菌的生化鉴定 分离菌分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖，且产酸不产气；分解马尿酸盐、还原硝酸盐、精氨酸；不分解纤维二糖、阿拉伯糖；并水解淀粉、七叶苷；靛基质试验阴性；V-P试验和过氧化氢酶试验阳性；不产生H2S。

2.3 细菌16S rRNA的PCR鉴定 分离菌株用16S rRNA PCR扩增出大约为1 492 bp的PCR目的基因条带(见图2)。分离菌株PCR产物测序结果与GenBank中登录的参考株金黄色葡萄球菌的基因序列同源性为98.9%～99.9%，分离菌株为金黄色葡萄球菌。

图2 分离菌株PCR扩增结果

2.4 致病性试验 试验组雏鸡攻毒后的48～72 h，个别雏鸡出现死亡，在死亡试验鸡的肝脏中分离到金黄色葡萄球菌，直到试验结束，对照组试验雏鸡无明显的症状。2～5组的死亡率分别为30%、70%、90%和100%，其分离菌株的LD50为3.16×106CFU/mL。因此证实了从病死雏鸡的体内分离到的金黄色葡萄球菌具有很强的致病性。

2.5 药敏试验 由表2可知，分离菌株对头孢曲松、头孢拉啶、环丙沙星、恩诺沙星、林可霉素5种药物敏感，对氨苄西林、阿莫西林、丁胺卡娜霉素、大观霉素4种药物中敏，对氟苯尼考、青霉素、新霉素、庆大霉素、多西环素5种药物耐药。

表2 药敏试验结果

2.6 多重耐药基因的PCR检测 由图3可知，分离菌株均扩增出了多重耐药基因cfr和fexA目的基因的条带。其PCR产物测序结果与GenBank中登录的参考株金黄色葡萄球菌的基因序列同源性为97.9%～99.8%，说明了分离的金黄色葡萄球菌同时携带多重耐药基因cfr和fexA。

图3 分离菌株多重耐药基因的PCR扩增结果

3 讨论

葡萄球菌是人类和动物体内的正常菌群，广泛存在于空气、饮水、饲料中及各种物品和人体的皮肤、黏膜、呼吸道、肠道中等，为环境中条件性致病菌，根据脂溶性色素的生化反应可以分为腐生葡萄球、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌3种，其中，金黄色葡萄球菌主要引起雏鸡急性败血症和关节炎[4-6]。魏晓巍等[6]报到了从病死的35日龄肉鸡肝脏、关节渗出液等病料组织中分离到致病性金黄色葡萄球菌。本试验从病死的16日龄雏鸡体内分离到了1株金黄色葡萄球菌，且对雏鸡有很强的致病性，其LD50为3.16×106CFU/mL。葡萄球菌为环境中的条件致病菌，该菌可以通过直接接触和空气传播，还可以通过创伤皮肤和黏膜传播，雏鸡也可以通过脐带感染传播[7-8]。因此，在雏鸡养殖过程中应注意环境卫生与消毒，加强平时的饲养管理，减少笼内的铁丝等尖锐物品引起皮肤损伤感染该菌，同时减少外界应激反应、提高机体的抵抗力，减少该病的发生与流行。国内关于肉鸡的葡萄球菌病较多，蛋雏鸡的葡萄球菌病报道较少。该菌可能对蛋雏鸡存在潜在的威胁，应引起重视。

S：敏感; I：中度敏感；R：耐药

S:Sensitivity; I:Moderate sensitivity; R:Resistance