3D打印羟基磷灰石-明胶支架联合BMSCs和HUVECs修复兔颅骨缺损的组织学评价*

王宏，范海霞，Tai-Hsien Wu，Ching-chang Ko，耿海霞

（1.潍坊医学院 口腔医学院，山东 潍坊 261053；2.济宁医学院 口腔医学院，山东 济宁272000；3.俄亥俄州立大学牙科学院 正畸学部，俄亥俄州 哥伦布 43210）

骨组织工程为骨缺损修复提供了新的方向。由于材料的不断改进，学者们对于骨替代材料的研究与构建，已从单一类型的支架材料逐渐过渡至复合型支架材料[1-2]。其中羟基磷灰石（Hydroxyapatite, HAP）和明胶（Gelatin, GEL）构成的复合型支架材料在组织工程学研究中具有很大优势，目前已成为骨组织再生领域中的研究热点[3]。研究表明，这种支架成分与天然骨组织中磷灰石矿物组成极为相似，具有仿生特性，且支架的机械、生物学性能好、骨传导性和骨结合能力强，在骨修复方面具有明显的优势[4-5]。近年来，随着3D 打印技术的发展，精确打印的三维多孔支架在骨组织工程领域得到广泛应用，成为颌面部骨缺损治疗的热点和新突破点[6-7]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）与脐静脉内皮细胞（HUVECs）是骨组织工程常用的种子细胞，有研究显示，将BMSCs 和HUVECs 种子细胞共培养，其成骨和成血管潜能较单独培养时提高[8]，可能为骨组织工程和骨再生提供一个很有前景的方法。

本实验根据前期实验[9]，制备出3D 打印HAPGEL 支架，负载BMSCs 和HUVECs 种子细胞后用于兔颅骨缺损修复，通过组织学观察其在临界大小骨缺损中的成骨修复效果，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物选用健康普通级、8 周龄、雄性新西兰大白兔24 只，动物许可证号：SCXK（鲁）20150001，体重1.5 ～2.0 kg，由济南西岭养殖繁育中心提供。

1.1.2 种子细胞BMSCs 和HUVECs 细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.3 HAP-GEL 支架材料HAP-GEL 支架由纳米级羟基磷灰石和明胶经3D 打印制备而成，直径8 mm，厚度2 mm，呈圆形片状，由美国北卡罗莱纳大学牙学院研究中心提供。

1.2 主要仪器与试剂

细胞培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司），水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司），庆大霉素（济宁辰欣药业股份有限公司），石蜡切片机（型号RM2235，德国莱卡公司），烘箱（型号Heratherm OMS60，美国Thermo Fisher Scientific 公司），苏木精-伊红染色试剂盒（北京索莱宝生物有限公司），Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），正置显微镜（型号E200，日本Nikon 公司）。

1.3 方法

1.3.1 复合体构建将EO 灭菌后的HAP-GEL 支架材料浸没于DMEM 培养基，并于恒温细胞培养箱（37℃，5%二氧化碳）内孵育24 h。共培养BMSCs 和HUVECs细胞并制成细胞悬液，HAP-GEL 支架浸泡于细胞悬液中，负压抽吸，静置于细胞培养箱中3 d，使种子细胞充分黏附。

1.3.2 动物模型的复制及分组新西兰大白兔称重后，用10%水合氯醛按3 ml/kg 行腹腔注射麻醉，待麻醉完毕后，将其俯卧位妥善固定于手术台，头部备皮，纵行切开颅顶部皮肤，仔细剥离骨膜，暴露颅骨。用环切刀在颅骨矢状缝左侧，慢速全层切除直径为0.8 cm 的圆形骨缺损，术中辅以滴水降温。将24 只新西兰大白兔编号后，随机分为空白对照组、阳性对照组、HAP-GEL 材料组及BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培养组，每组6 只。空白对照组留置空白缺损；阳性对照组在骨缺损处随机植入自体颅骨；HAP-GEL 材料组在骨缺损处随机植入HAP-GEL 支架；BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培养组在骨缺损处随机植入HAP-GEL 支架与BMSCs 和HUVECs细胞复合体。术区组织分层对位缝合，术后肌内注射庆大霉素4 万u/d，1 次/d，共3 d。

1.3.3 组织学观察分别于术后4 周和12 周处死新西兰大白兔，于组织工程骨成骨区外3 mm 取材，4%多聚甲醛固定48 h，10% EDTA 溶液常温下脱钙处理，脱钙液更换频率为1 次/3 d，期间用大头针轻戳标本，至针头可轻松刺入标本提示脱钙完成。标本流水冲洗过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，制成厚度为4μm 的组织切片，行HE 染色及Masson 染色，在光学显微镜下观察各组材料与组织相容性、新生骨组织和骨质成熟情况。

2 结果

2.1 大体观察

术后7 d 切口达到一期愈合。术后新西兰大白兔无死亡，术区无感染，饮食、活动正常。

2.2 HE 染色

各组均未见明显炎症细胞浸润。术后4 周，空白对照组骨缺损区内仅有少量纤维结缔组织生成，呈网格状，稀疏排列（见图1A）；HAP-GEL 材料组有少量新骨生成，呈岛状散在分布于纤维结缔组织及不规则骨小梁中（见图1B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培养组可见部分新骨开始彼此融合（见图1C），新生骨量与阳性对照组相似（见图1D）。术后12 周，空白对照组可见缺损区内仅有小面积骨岛形成（见图2A）；HAP-GEL 材料组新骨相互融合，呈较大面积的板层状（见图2B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培养组新生骨量较前两组明显增多，缺损区几乎全部被新骨充填（见图2C）；阳性对照组新骨形成量与BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培养组相似（见图2D）。

图1 术后4 周各组骨缺损处的组织学观察 （HE 染色×100）

图2 术后12 周各组骨缺损处的组织学观察 （HE 染色×100）

2.3 Masson 染色

术后4 周，空白对照组仅存在少量纤维组织充填于骨缺损区（见图3A）；HAP-GEL 材料组内有蓝染的新生骨形成，并已出现少量夹杂蓝染新骨的红染成熟骨，但着色均较浅（见图3B）；BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培养组可见深染蓝色新骨包绕支架，且红染成熟骨面积较HAP-GEL 材料组大（见图3C），修复效果与阳性对照组相似（见图3D）。术后12 周，空白对照组内有蓝染新生骨组织生成（见图4A）；HAP-GEL 材料组成熟骨面积进一步扩大，支架被分割包裹、吸收（见图4B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培养组可见大片红染成熟骨，其间夹杂少量蓝染新生骨，支架仅残存少量（见图4C），成骨效果与阳性对照组相似（见图4D）。

图3 术后4 周各组骨缺损处的组织学观察 （Masson 染色×100）

图4 术后12 周各组骨缺损处的组织学观察 （Masson 染色×100）

3 讨论

种子细胞是骨组织工程骨研究的基础。其中BMSCs 因来源丰富、具有较强的体外增殖能力和成骨分化潜能，已成为公认的较为理想的种子细胞[10-12]。而HUVECs 也因可产生多种因子，以及不涉及安全性和伦理学等问题，成为组织工程学研究中应用较为广泛的种子细胞之一。研究证实，将上述2 种细胞共培养，具有相互协同的作用。加入HUVECs 后，可促进BMSCs中I 型胶原和碱性磷酸酶的表达上调；HUVECs 也可通过调控转录因子Dlx5、Cbfa1/Runx2、Osterix 的表达，增强BMSCs 的成骨能力，从而构建有利于骨生长及骨重建的局部微生态环境[13-16]。在本实验中，笔者通过Masson 染色证实，BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培养组可见明显的蓝染新骨在支架材料周围聚集形成，术后12 周，还可见大量的成熟骨连接成片，成骨效果和阳性对照组接近。HE 染色结果也验证了上述发现。上述结果表明，HUVECs 和BMSCs 可能通过分泌某些细胞因子、转录因子，加速骨缺损的修复过程。

支架材料是组织工程骨的重要组成部分，理想的支架材料应具备与天然骨组织相似的性能，以模拟其修复效果[17]。HAP 是一种天然的磷灰石矿物，参与构成骨组织中50%～70%的矿物质成分[18]，其凭借自身优越的生物相容性、骨诱导性及低免疫原性，成为目前应用最多的生物材料[19]。普通HAP 粒径较大，生物降解性较差，韧性不佳；但纳米级HAP 具有更好的表面效应，生物活性与降解性亦优于普通HAP[20-21]。GEL 具有良好的生物学性能，易于降解，且结构中含大量亲水基团，可支持种子细胞的种植；此外GEL含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽序列，能够增加细胞的识别位点，促进种子细胞在支架上黏附、生长[22-24]。但GEL 力学性能较差，严重影响了其在临床上的进一步应用[25]。研究表明，纳米级HAP 与GEL复合支架，能够模拟天然骨的成分与微结构特征，具有与周围骨组织键合的能力[26-27]；同时GEL 可提高支架的降解速率；HAP 能够改善支架的机械和生物性能，实现两者优势互补[28]。本课题组前期研究制备合成HAP-GEL 支架，复合成骨细胞后用于兔颅骨缺损的修复，发现其具有一定诱导骨生成的作用[9]。而本实验中采用的3D 打印HAP-GEL 支架具有以下优势：①支架采用3D 打印，能够更好地与骨缺损区匹配；②术后切口处愈合良好，无明显排异反应；组织学观察也未见明显的炎症细胞浸润，说明3D 打印HAPGEL 支架具有良好的生物相容性；③支架结构为种子细胞BMSCs 和HUVECs 的黏附、生长及相互作用提供了一种生理性的优化环境。HE 和Masson 染色结果证实，与空白对照组相比，HAP-GEL 材料组，可明显促进新生骨的形成，而BMSCs+HUVECs+HAP-GEL支架共培养组成骨效果与自体移植骨类似。这表明，3D 打印HAP-GEL 支架材料具有良好的成骨效果。

综上所述，本实验所采用的3D 打印HAP-GEL支架材料具有良好的骨诱导作用，且在种子细胞BMSCs 和HUVECs 的作用下，可更好地修复颅骨缺损，为临床应用提供理论依据。本实验仅对3D 打印HAP-GEL 支架材料复合种子细胞对颅骨的修复效果进行了组织学层面的分析，其具体的修复机制还需要进一步深入研究。