新型冠状病毒血清特异性抗体检测的假性问题分析和对策探讨

宁明哲,陶月,陈雨欣,柏 兵（南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京210008）

2019年底发现的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)迅速席卷全球，已成为全球的公共卫生大事件，对全球各地区人民的生命健康和经济带来巨大损失。新型冠状病毒感染导致的疾病称为新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)，据世界卫生组织的实时数据统计，截止2020年7月4日，全球COVID-19 确诊病例达1 130 多万例，死亡人数超过52 万。目前，我国的防控防疫工作已取得阶段性成果，COVID-19 抗体检测是进行流行病学调查的主要方法。同时，国家卫生健康委员会2020年3月3日发布的“新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）”，已明确将 COVID-19 IgM 和IgG 抗体作为临床确诊标准[1]。然而，在4月份国家药品监督管理局也提出抗体检测试剂仅用作对SARSCoV-2 核酸检测阴性疑似病例的补充检测[2-5]，或在疑似病例诊断中与核酸检测协同使用，不作为SARS-CoV-2 感染者确诊和排除的依据，也不适用于一般人群的筛查。这提示现有SARS-CoV-2 抗体检测试剂使用过程中可能存在一定的假阴性和假阳性情况。

目前被国家药品监督管理局批准的COVID-19抗体检测试剂盒厂家有广州万孚生物技术股份有限公司 、唐山英诺特生物技术有限公司、博奥赛斯（重庆）生物科技有限公司、厦门万泰凯瑞生物技术有限公司 、珠海丽珠试剂股份有限公司、珠海经济特区海泰生物制药有限公司、上海芯超生物科技有限公司、南京诺唯赞医疗科技有限公司、博奥赛斯（重庆）生物科技有限公司、广东和信健康科技有限公司与丹娜（天津）生物科技有限公司。上述检测试剂盒主要检测SARS-CoV-2 特异性的IgM 和IgG 抗体，检测方法包括酶联免疫法、化学发光法及胶体金免疫层析法，包被的抗原包括SARS-CoV-2的N蛋白（Nucleoprotein）、M蛋白（Membrane protein）和S 蛋白（Spike glycoprotein）。需要提出的是，本次流行的SARS-CoV-2 与曾经流行的Bat-SL-CoV，SARS-CoV 与MERS-CoV相比，N，M和S 蛋白在氨基酸序列上具有极高的相似性（90%左右）[6]。这是检测方法中的抗原设计及结果判断应当考虑的因素。除此之外，COVID-19 的基因末端多出一个新的ORF10 基因，表达38 个氨基酸。用它作为抗原表位，可极大保证COVID-19 抗体检测的特异性，但目前的相关研究和应用很少。

由于包被抗原选择的复杂性、高质量抗体制备的困难性以及免疫学检测方法本身的局限性，敏感度高、特异度强的试剂盒需要通过严格的性能验证。由于疫情的迫切性，上述在极短时间内生产出的COVID-19 抗体检测试剂盒，虽然总体性能尚可，但也出现了一些检验结果与临床表现和流行病学特征不相符的现象。现对它们进行初步探讨，并提供一些应对思路。

1 COVID-19 抗体检测中的假阳性问题

1.1 既往冠状病毒感染 COVID-19 属于β 家族的冠状病毒[7]。根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库，β 家族冠状病毒该家族中有六种、173 个病毒。COVID-19 中的N 蛋白、P 蛋白、S 蛋白在氨基酸序列上除与非典型性肺炎病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus， MERS-CoV) 有高达90%以上的相似度外，还有多种其它冠状病毒在基因序列比对中显示有类似氨基酸序列。这些病毒多数不致病，但因为有类似序列，可以在人体内产生干扰性抗体，从而导致COVID-19 抗体检测的假阳性问题。该种情况一般导致IgG 抗体假阳性，但不排除IgM 假阳性。

1.2 交叉抗体的存在 人体正常情况下含有1011（1 000 亿）个B 细胞，至少可结合1 000 万种不同抗原表位以上的抗体[8]。而正常机体每天产生109个新的B 细胞。如此庞大的表位结合多样性，完全有可能随机产生能与包被在检测载体中的抗原片段结合的抗体。另外，人体在环境中可受到近1 400 种病原体感染，或接受各种致敏原的刺激，会产生更多新的抗体，极大增加了不同人体间抗体库构成的复杂性，使得干扰抗体可以随机存在。这种情况下的假阳性，应仅IgG 抗体或IgM 抗体阳性[10]。

1.3 高浓度弱亲和力的抗体或蛋白干扰 根据抗原抗体结合的反应公式（[Ab]+[Ag]=[Ag-Ab]）及解离常数Kd=[Ab]*[Ag]/[Ag-Ab]。Kd 越大，亲和力越小。一般鼠单抗的亲和力在1nmol/L 左右（10-9mol/L），兔单抗的亲和力在0.01nmol/L 左右（10-10mol/L）。人体正常血清中IgM 总浓度约为1mg/ml，针对某一表位的抗体IgM 浓度估计在总IgM 浓度的万分之一以下，因此其有效浓度不超过1nmol/L。在抗原为10nmol/L（约1 µg/ml）和Kd 为1nmol/L 的情况下，1nmol/L 的IgM 将与9%的抗原结合。当Kd 降低1 000 倍（1 000nmol/L）时，仅有0.1%的抗原被结合，导致检测信号将降低100 倍。然而，当这种低亲和力的抗体浓度1 000 倍增高时（1 000nmol/L），近50%的抗原被结合。而这种亲和力高浓度的杂质分子在血液中经常存在。比如，一般细胞因子的浓度在1ng/ml 左右，而清蛋白在50mg/ml 左右，有着千万倍数的差异，可对检测造成干扰。

1.4 方法学本身的问题 特别是胶体金免疫层析法。这种方法方便快捷、便于床边诊断，但检测过程中没有充分的清洗过程，难以有效去除非特异性结合物质。这种情况下，可用缓冲液手工充分洗涤。真阳性的结果，一般不受洗涤明显影响。

1.5 其它常见因素的干扰 如类风湿因子（rheumatoid factor，RF）[9]、补体、嗜异性抗体、溶菌酶等。

2 COVID-19 抗体检测中的假阴性问题

2.1 检测试剂中的抗原设计与制备 这些抗原蛋白的制备一般采用肽段合成或在质粒表达的方法。合成的肽段和在大肠埃希菌中所表达的肽段没有人体中正常情况下的翻译后修饰（post-translational modification）。在真核细胞中表达的蛋白的翻译和修饰是否与COVID-19 所感染的肺泡上皮细胞中产生的修饰相同尚不清楚。比如SARS-CoV 的S 蛋白有高达23 个糖基化位点和7 个二硫键。这些被修饰的位点对线性和空间抗原表位有着决定性作用，在合成或重组表达的抗原中未必完全存在，这样就可能导致检测的假阳性。

2.2 双抗原夹心法容易产生假阴性结果 这种方法需要两个抗原与抗体特异性反应同时存在。前已述及，由于抗原抗体反应的平衡性及Kd 常数，抗原与抗体并非100%结合。假如只有70%结合时，两者同时结合，以形成最终的有效被检测物时，只有近一半（49%）。双抗原夹心法检测抗体的另一个缺点是空间位阻问题。包被抗原与标记抗原在待测血清标本中并非游离存在。因为血清的蛋白浓度极高（50～70 µg/µl），蛋白容易相互附着。一个抗体双臂上抗原结合区域之间的空间较小。当包被抗原与标记抗原与待测血清中的蛋白有相互附着时，会因为空间位阻的原因而影响其与待测抗体的结合，而造成检测的假阴性。

2.3 试纸条的胶体金免疫层析法更易产生假阴性结果 相对于其它常规免疫学检测方法中30 min 左右的抗原抗体结合时间，胶体金试纸条法的反应时间一般在1 min 内完成，抗原抗体可能无法充分混匀及反应，造成假阴性的结果，而且阳性结果的线性定量关系较差。另外，在胶体金试纸条检测COVID-19 抗体的方法中，抗原包被膜条，胶体金标记抗人IgM 或IgG。在人血清标本中IgM 和IgG的含量极高，而真正待测抗体的浓度应该在万分之一以下，而胶体金标记的二抗与血清标本中如此高浓度的IgM 或IgG 完全结合，导致因灵敏度不足而出现的检测假阴性。

2.4 其它导致检测假阴性的常见问题 如基质干扰、钩状反应等。

3 COVID-19 抗体检测问题的解决思路

3.1 同时检测针对SARS-CoV-2 的IgM 和IgG 抗体[10-11]，在接触感染源后的第一个星期左右，IgM和IgG 可同时出现阳性。同时检测针对SARSCoV-2 的IgM 和IgG 抗体可提高敏感度。

3.2 动态检测SARS-CoV-2 的IgM 和IgG 抗体感染初期，第一次抗体检测阳性时，在3～7 天后再次检测，IgM 和IgG 水平一般都出现4 倍升高。

3.3 建议用不同蛋白（如联用N 蛋白和S 蛋白）或不同序列的肽段作为包被抗原的试剂盒，进行复查。如为假阳性，两者同时阳性的可能性较小。

3.4 对金标试纸条可能存在的假阳性，可考虑用磷酸盐（PBS）缓冲液洗涤震荡3～5 次；对金标试纸条的假阴性，可考虑将前端含有胶体金的垫片取下，先将试纸条插入血清中进行充分层析。然后将膜条移入新的滤纸，并在洗脱的胶体金中进行层析。

3.5 对于非特异性蛋白吸附造成空间位阻的问题，可在样本中加入较强的去垢剂。一般免疫学检测方法中所用的缓冲液仅含0.05%的吐温-20，不足以去除较强干扰蛋白的吸附。此时可考虑选择1%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），甚至RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）缓冲液。这可适用于胶体金试纸条法，但不适用于抗原或抗体被动吸附于固相载体上的免疫学方法。

3.6 怀疑为类风湿因子（RF）等干扰时，可直接检测RF水平；当RF水平较高时，可考虑为RF水平的干扰。

4 结论

血清新型冠状病毒特异性的抗体检测是对疑似新型冠状病毒患者的补充检测。但是如果将抗体检测应用于临床大规模检测时，则需要考虑潜在检测假阳性和假阴性的问题，本文也提出了一些解决思路。相信随着对SARS-CoV-2研究的深入，抗体检测方法和检测性能会愈发完善，从而有可能用于大规模人群的筛查和诊断中，以更好地帮助临床诊断和流行病的回顾性研究。