基于代谢组学的肾细胞癌生物标志物研究进展

邵渊 吴波 王东文

肾细胞癌简称肾癌，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，2020年美国的肾癌年发病人数分别占男性和女性新发肿瘤的第6位和第8位[1]。近年来我国肾癌的发病率虽然低于世界平均水平，但也呈现逐年上升趋势[2-3]。早期肾癌通常无明显症状，超过20%的患者在诊断时已经进展为局部晚期或转移性肾癌，预后较差[4]。由于肾癌对放疗及化疗不敏感，因而早期诊断和早期手术治疗显得尤为重要[5]。当前，肾癌的诊断除影像学检查外，尚无特异性的肿瘤标志物，肾肿物穿刺活检术的临床应用也因存在针道转移等风险而受到限制[6]。因此，为了改善肾癌患者的预后，迫切需要寻找和开发具有临床应用价值的肾癌生物标志物。

作为一种新兴组学技术，代谢组学主要通过质谱(mass spectrometry, MS)和核磁共振谱(nuclear magnetic resonance, NMR)等技术平台定性或定量检测生物样本内相对分子质量小于1 000 D的内源性小分子物质的变化水平，结合主成分分析(pincipal component analysis， PCA)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least square discriminant analysis， OPLS-DA)等多元统计学方法从中挖掘差异代谢产物并进行生物学解释[7-8]。由于代谢组学侧重于反映生物体内真实的病理生理变化状态，目前已经在多种恶性肿瘤发生机制的研究以及非侵入性肿瘤标志物的发现等方面表现出独特的优势[9-11]。作为一种代谢性疾病，肾癌在发生发展过程中的关键基因如VHL、MET等突变与代谢途径及代谢网络重编程密切相关[12-14]。因此，通过代谢组学手段分析肿瘤患者体内的差异代谢产物，并从中发现一种全新有效的肾癌生物标志物成为当前的研究热点。

一、基于尿液样本的肾癌代谢组学研究

由于尿液直接与泌尿系统接触且具有收取无创、易于获取等诸多优势，使其成为肾癌代谢组学分析的首选生物标本[15]。Kim等[16]利用代谢组学方法分析了29例肾癌患者和33例健康志愿者的尿液样本，结果显示肾癌患者尿液中的喹啉酸含量升高，4-羟基苯甲酸和龙胆酸降低，结合后续细胞株实验表明氨基酸代谢和能量代谢途径中的喹啉酸和α-酮戊二酸是肾癌潜在的生物标志物。在另外一项研究中，Ganti等[17]采用气相色谱质谱联用(gas chromatography-mass separetion, GC-MS)的方法分析了不同级别肾癌患者的尿液样本，发现低级别肿瘤中脂酰肉碱的平均值较低，而其浓度在高级别肿瘤患者的尿液中稳定增加，表明来自脂肪酸代谢途径的脂酰肉碱作为潜在的生物标志物与肾癌的分级密切相关。Monteiro等[18]采用GC-MS技术研究了30例肾癌患者和37例非肾癌志愿者尿液中的挥发性有机化合物(volatile organic compounds, VOCs)。基于这种非靶向分析方法，研究发现尿液中由21种代谢物构成的组合可以有效区分肾癌患者与非肾癌志愿者，其中的2-氧丙醛和2，5，8-三甲基-1，2，3，4-四氢萘-烯-1-醇变化最为显著，可以作为潜在的肾癌生物标志物。该研究证实了尿液中VOCs的鉴定与评估在肾癌生物标志物的发现中具有很大的潜力，值得进一步探讨与研究。Liu等[19]应用液相色谱质谱联用(liquid chromatography-mass separetion, LC-MS)技术分析100例肾癌患者与163例非肾癌患者(包括34例良性肾肿瘤和129例健康志愿者)的尿液样本，发现一种肾癌的特征性生物标志物—N-甲酰犬尿氨酸。分析结果显示，作为一种潜在的肾癌生物标志物，色氨酸代谢途径中的N-甲酰犬尿氨酸在区分肾癌患者与非肾癌患者时，敏感度和特异度分别达到84.8%及83.8%，具有较高的诊断潜力。最近，Zhang等[20]利用LC-MS技术进行了一项基于39例肾癌患者、22例良性肾肿瘤患者以及68例健康对照者的尿液代谢组学研究。结果发现肾癌患者尿液中的代谢谱与良性肾肿瘤患者及健康对照者尿液中的代谢谱具有显著差异。进一步分析显示，由睾酮等组成的代谢物组在区分肾癌和良性肾肿瘤时，灵敏度和特异度均为80%，而由氨基己二酸等组成的代谢物组在区分肾癌患者与健康对照者时，灵敏度和特异度分别为93%和75%。作为潜在的肾癌生物标志物，以上两组代谢物均具有较高的诊断价值。

Ragone等[21]应用核磁共振氢谱(proton nuclear magnetic resonance,1H-NMR)技术结合多元统计方法对40例肾透明细胞肾癌患者、29例健康对照者的尿液样本进行了分析。结果表明，肾透明细胞癌患者尿液中水平升高的肌酸、丙氨酸、乳酸和丙酮酸，以及水平降低的马尿酸、柠檬酸和甜菜碱是肾癌潜在的生物标志物。此外，该研究通过分析9例肾切除术后的尿液样本，发现肾癌患者手术前后的代谢谱发生了明显的变化，提示尿液代谢组学的分析可能会为肾癌患者的术后监测提供帮助。最近，Falegan等[22]应用NMR技术对74例肾透明细胞癌、6例嫌色细胞肾细胞癌和24例乳头状肾细胞癌患者的空腹尿液样本进行了一项初步研究。基于多元统计学分析结果显示肾癌各亚型之间存在一定的差异，脂肪酸代谢途径中的乙酰肉碱可能是区分肾癌组织学类型的生物标志物。这项研究证实尿液代谢组学可以在肾癌分型诊断中发挥作用。但限于样本量的限制，尤其是嫌色细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌等组织学类型的样本量较少，有待后续的大样本研究进一步探讨尿液代谢组学在肾癌分型诊断中的应用。基于以上的研究，尿液代谢组学为肾癌非侵入性生物标志物的发现提供了新的视角。

二、基于血液样本的肾癌代谢组学研究

血清肿瘤标志物是早期发现肿瘤、监测肿瘤进展以及评价治疗疗效的重要方法。因此基于血液样本的代谢组学技术有望在寻找肾癌血液生物标志物方面发挥重要作用。Lin等[23]使用LC-MS和直接输注大气压电离化质谱技术对收集的31例肾癌患者和20例健康志愿者血清样本进行了分析处理。研究发现，与健康人相比，肾癌患者血清中苯乙酰甘氨酸和神经节苷脂水平升高，而溶血磷脂酰胆碱水平明显下降。进一步研究显示血清中苯乙酰甘氨酸水平升高与肾癌患者体内脂肪酸代谢紊乱有关，而溶血磷脂酰胆碱和神经节苷脂作为恶性肿瘤的生物标志物，在肿瘤的生长和转移中起着至关重要的作用。随后，Lin等[24]进行了一项基于33例肾癌患者及25例健康志愿者的血清代谢组学研究。分析结果提示LC-MS分析与多元统计分析相结合可用于肾癌的诊断及肿瘤标志物的筛选，其建立的诊断模型区分肾癌患者和健康志愿者的敏感性和特异性均达到100%。此外，该研究最终筛选出30个用于肾癌诊断的潜在生物标记物，并对其相关代谢途径进行了研究，提示肾癌患者体内存在脂肪酸代谢、色氨酸代谢等多种代谢途径的紊乱。

Zira等[25]分析了32例肾癌患者和13例泌尿系良性疾病患者血浆样本中代谢物的变化情况，结果表明1H-NMR技术与PCA相结合的方法在肾癌诊断中具有潜在的应用价值，其筛选出的脂蛋白和胆碱可能是肾癌诊断的生物标志物。Zheng等[26]采用基于NMR的血清代谢组学方法对104例肾癌患者及健康志愿者的血清样本进行了研究。结果提示，血清中丙氨酸、肌酸、胆碱、异亮氨酸、乳酸、亮氨酸和缬氨酸不仅可作为潜在的肾癌生物标志物，还可用于肾癌的早期诊断，而且可以成为肾癌患者肾切除术后代谢恢复的标志物。最近，Falegan等[27]应用NMR和GC-MS技术对40例肾癌患者和13例良性志愿者的血清样本进行了分析。与对照组相比，肾癌患者血清中糖酵解产物丙酮酸和乳酸水平上升, 而三羧酸循环中间产物琥珀酸、柠檬酸水平降低，进一步证实了肿瘤细胞即使在氧气充足的条件下，仍然依赖糖酵解的方式产生能量以维持其快速增殖，即沃伯格效应(Warburg effect)[28]。此外，该研究通过分析28例pT1期及10例pT3期肾癌患者血清样本，结果显示基于OPLS-DA模型可以有效区分不同分期的肾癌患者，证明了血清代谢组学在肾癌的分期诊断方面具有很大的潜力。

三、基于组织样本的肾癌代谢组学研究

相较于尿液与血液，组织样本提供的代谢信息最为丰富。因此，有学者试图在肾癌患者的组织样本中，利用代谢组学技术寻找可用于肾癌诊断的特异性标志物。Poplawski等[29]采用GC-MS技术分析了35例肾癌患者肾切除术后的肿瘤组织及邻近的正常肾组织，旨在探讨肾癌患者体内代谢途径的改变对生存的影响。研究共发现31种差异代谢物，其中琥珀酸、腺嘌呤、肌醇、次黄嘌呤、尿素和β-丙氨酸作为肾癌生物标志物具有较好的诊断价值。进一步分析发现肾癌组织中的琥珀酸、嘌呤、葡萄糖、β-丙氨酸和肌醇等代谢物水平的变化与肾癌患者的低生存率相关。Niziol等[30]采用液相色谱-高分辨质谱法分析了肾癌组织与正常肾组织。研究发现，脂质代谢途径的乙酰肉碱与氨基酸代谢途径的谷氨酰胺浓度在肿瘤组织中显著增高，可以作为潜在的肾癌生物标志物。Sato等[31]分析了20例肾透明细胞癌患者的癌组织及正常肾组织，共发现58种差异代谢物，其中来自甘油磷脂、谷胱甘肽、糖酵解等代谢途径的34种代谢物作为潜在的肾癌生物标志物具有较高的诊断能力。进一步分析发现有9种代谢产物与肿瘤体积显著相关，可以作为早期诊断的肾癌生物标志物。此外，该研究还发现包括α-酮戊二酸和肌醇在内的19种代谢产物与临床病理因素显著相关，为肾癌代谢组学研究带了新的思路与见解。Gao等[32]利用1H-NMR技术结合多元统计学方法对31例肾癌组织及癌旁正常组织进行分析。结果显示，肾癌组织中的代谢谱与其邻近癌旁正常组织的代谢谱具有明显差异。与癌旁组织相比，肾癌组织中谷氨酸、谷氨酰胺水平升高提示肿瘤细胞抗氧化能力的增强，而乳酸和丙酮酸水平的升高以及苹果酸、琥珀酸、延胡索酸等水平的降低提示肿瘤细胞的三羧酸循环受到抑制，进而转为有氧糖酵解作为主要的能量来源。以上这些研究结果表明，基于组织样本的肾癌代谢组学研究将促进肾癌生物标志物的发现与探索。

四、总结与展望

目前，虽然代谢组学在肾癌研究中发展迅速，但也存在着一定的局限性：①到目前为止进行的代谢组学研究表明，肾癌的代谢特征缺乏特异性；②机体代谢物易受多方面因素的干扰，且样本制备与分析缺乏统一的标准，造成各研究的一致性较差；③部分研究样本量较少，缺乏有效的内部及外部验证，实验结果的准确性难以保证；④虽然组织病理学检查作为肾癌诊断的金标准，但其临床标本获取较为困难，不利于肾癌的早期诊断与筛查。

总而言之，基于代谢组学发现的肾癌生物标志物距离实际临床应用还有一定的距离。然而，越来越多的研究表明，肾癌作为一种代谢性疾病，与糖酵解、三羧酸循环、脂肪酸β氧化及色氨酸途径的代谢重编程密切相关(图1)。因此，了解肾癌的代谢特征有助于生物标志物的发现与应用。相对于其它“组学”技术，代谢组学处于基因组学和蛋白质组学下游，为肾癌的发生机制及非侵入性生物标志物的发现等多个方面提供了新的视角和贡献。鉴于个体之间的巨大异质性，加之众多混杂因素的影响，单个生物标志物不太可能提供强大的诊断价值，因此，未来研究的方向可能会侧重于一组生物标志物的发现与应用。此外，由于组织样本提供的代谢信息最为丰富，而血液、尿液代谢组学研究具有无创性等优势。因此，后续的研究可将组织代谢组学与基于血液及尿液的代谢组学研究相结合，进一步深入挖掘灵敏度高、特异度强的非侵入性肾癌生物标志物。

综上所述，随着研究的深入以及技术的不断创新，不断趋于可靠与稳定的代谢组学技术为癌症研究提供了一条极具潜力的途径。通过与基因组学、转录组学、蛋白质组学相结合，肾癌生物标志物的发现与应用使得以个性化的方式对肾癌进行快速且非侵入性的诊断和随访成为可能。