KOD DNA聚合酶荧光PCR技术在肺结核诊断中的应用评价

黄明翔，陈新朝，陈晓红，方美兰

据世卫组织报告，结核病仍是危害人类健康的重大疾病，是全球十大死亡原因之一。我国是结核病高负担国家，结核病病例居世界第2位，防治形势严峻[1]。结核病的早期诊断对及时治疗患者，控制其传播具有十分重要的意义。传统的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)涂片显微镜检查阳性率低且不能区分阳性菌是结核还是非结核分枝杆菌(non-tuberculosisMycobacterium，NTM)，而培养需要3～8周的时间不能满足快速诊断的要求。近年来，兴起的分子生物学方法具有快速、敏感性高等特点，多种分子生物学检测技术已应用于结核病诊断，并成为结核病诊断标准之一[2]。

本研究使用的PCR荧光探针检测试剂盒是针对MTB的DNA J基因设计2条特异性引物，通过KOD DNA聚合酶采用荧光探针Q Probe对样本中的结核分枝杆菌相应的核酸片段进行扩增检测。DNA J基因是Hsp40(热休克蛋白)的成员之一，控制热休克σ因子32，已用于包括军团菌、葡萄球菌、链球菌等多种细菌研究[3]。KOD DNA聚合酶来源于超嗜热古菌(ThermococcusKodakaraensis)，与临床常用PCR反应体系的Taq DNA聚合酶比较，它的合成速度是Taq DNA聚合酶的2.5倍[4]，因此具有很高的检测效率。但因为KOD DNA聚合酶具有很高的DNA延长能力以及过强的3′-5′核苷酸外切酶活性，所以其在PCR中很难控制，国内有少部分高校科研院所在使用KOD DNA聚合酶开发产品，但截至目前为止，国内外还没有相关技术在结核病诊断应用的报道。本研究旨在通过应用该方法检测临床结核病疑似患者痰样本，以临床诊断为参照，MGIT960液体培养法为金标准，基于Taq DNA聚合酶荧光PCR为对照方法，探讨KOD DNA聚合酶荧光PCR在结核病快速诊断的应用价值。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取2019年10月至2020年4月在我院结核科住院的具有肺结核症状、体征的疑似肺结核病患者作为研究对象，收集患者痰标本进行涂片抗酸染色、MGIT960液体培养、KOD DNA聚合酶荧光PCR检测及Taq DNA聚合酶荧光PCR检测。

1.2临床诊断及随访 临床医生根据患者的痰涂片结果、影像学诊断结果(胸片或CT)和临床检查结果对患者进行初步诊断，对于确诊肺结核患者进行抗结核治疗。2个月后对KOD DNA聚合酶的荧光PCR检测阴性排除肺结核患者进行随访，以确认最终诊断结果。

1.3主要仪器与试剂 BACTEC MGIT960液体培养仪及配套试剂，美国BD公司；TCG-D1全自动核酸提纯及定量荧光PCR分析系统，日本東洋紡株式会社；ABI7500全自动实时荧光定量PCR仪，美国Life Technologies Holdings Pte Ltd。抗酸染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；商品化配套试剂盒包括：聚合酶试剂[KOD Mix]、引物MTB F：5′-ACGGCGCTGAGTTCAACCTCAACG-3′、反向引物MTB R：5′-GAACAAGCCACCGAACAAGTCACCGAT-3′、Q探针: 5′-CGAACCGGCGGTACCAC-3′，以上试剂购自日本東洋紡株式会社； Taq DNA聚合酶荧光PCR法选用中山大学达安基因试剂。

1.4 研究方法

1.4.1伦理情况 本试验通过福州结核病防治院伦理委员会批准(批件号：2018-008(科研)-01)。

1.4.2临床诊断 肺结核诊断标准参考《WS 288—2017肺结核诊断》[5]，以患者的出院诊断作为临床诊断结果。

1.4.3痰涂片抗酸染色检查 按照《结核病实验室检验规程》[6]。

1.4.4MGIT960液体培养法 严格按照BACTEC MGIT960系统操作说明书进行培养，吸取约5 mL(不超过10 mL)痰液加入带有螺旋帽的50 mL离心管中，加入与标本等量的NaOH-NALC前处理液，振荡消化15 min，加入40 mL pH6.8磷酸缓冲液(PBS)，3 000 g离心15 min，弃上清，加入1～2 mL PBS(pH6.8)，以制备成悬浊液，0.5 mL接种至准备好的MGIT培养管进行液体培养。培养结果由仪器自动报告阳性后，进行抗酸涂片和菌种鉴定。

1.4.5菌种鉴定方法 应用PNB和TCH生长试验进行初步菌种鉴定，PNB不生长TCH生长鉴定为MTB，PNB、TCH均生长鉴定为NTM[6]。

1.4.6Taq DNA聚合酶荧光PCR 取1 mL痰液中加入4倍体积的4%氢氧化钠摇匀，室温下液化30 min，取0.5 mL至1.5 mL离心管中，再加入0.5 mL 4% 氢氧化钠摇匀，室温放置10 min后15 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀加1 mL无菌生理盐水打匀，15 000 r/min 离心5 min，再重复洗涤1次，沉淀直接加50 μL DNA提取液充分混匀，100 ℃水浴10 min，转至4 ℃静置6～8 h以保证充分裂解，10 000 r/min离心5 min，取上清液2 μL做PCR反应。阳性判断：Ct值<30实验结果为阳性。

1.4.7KOD DNA聚合酶荧光PCR 取100 μL的样品与等量溶解吸附液到研磨管进行混合，80 ℃下加热 10 min进行灭菌，将研磨管置于漩涡振荡器上振荡 20 次，加入 800 μL溶解吸附液，13 000 g，离心 3 min，取 170 μL上清液到试剂分装盒，封上铝箔纸， 放置试剂分装盒到仪器里，按全自动分析系统操作说明书操作。熔解曲线荧光峰值大于≥10。

1.4.8PCR扩增条件设置 见表1。

表1 两种方法PCR扩增条件

1.5采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析 用kappa检验验证2种方法检测结果的一致性。Kappa≥0.75表示二者一致性较好；95%CI均采用“正态近似法”进行计算；两种方法结果差异统计学分析采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1病例入选及诊断类型 共收集344例，其中肺结核疑似患者237例，排除12例出院诊断不明确及7例经培养鉴定为非结核分枝杆菌感染患者，纳入最后结果分析的临床诊断结核病有效病例为218例，非肺结核患者107例。

2.2入选病例基本情况 入选病例中临床诊断为肺结核患者218例，非肺结核患者107例。其中，男性236例(72.6%)，女性89例(27.4%)；<20岁患者20例(6.2%)，≥20岁65例(20.0%)，40～岁119例(36.6%)，60～岁121例(37.2%)。具体情况见表2。

表2 纳入样本人群信息

2.3抗酸杆菌涂片结果 218例肺结核患者中涂片阳性84例(38.53%)，涂片阴性134例(61.47%)。

2.4两种不同DNA聚合酶荧光PCR结果比较 在纳入统计有效样本325例中，KOD DNA聚合酶法和Taq DNA聚合酶法阳性符合率为92.94% (95%CI：89.09%～96.79%)，阴性符合率为94.19% (95%CI：90.51%～97.88%)，总符合率 93.54% (95%CI：90.87%～96.21%)。两种检测方法比较，Kappa=0.871>0.75，检测结果有较好的一致性，见表3。

表3 两种荧光PCR结果比较

2.5KOD DNA聚合酶荧光PCR检测结核分枝杆菌效能

2.5.1以临床诊断结果为标准，评价KOD DNA聚合酶荧光PCR检测效能，并与结核分枝杆菌液体培养、Taq DNA聚合酶荧光PCR进行比较 在临床诊断的肺结核患者中，MGIT960液体培养、Taq DNA聚合酶荧光PCR、KOD DNA聚合酶荧光PCR的敏感度分别为71.56%、76.15%、76.61%，KOD DNA聚合酶荧光PCR与MGIT960液体培养检测敏感度差异无统计学意义(χ2=1.445，P=0.229>0.05)，见表4。

表4 与临床诊断结果比较，MGIT960培养及两种荧光PCR检测结核分枝杆菌效能

2.5.2以液体培养试验结果为标准评价KOD DNA聚合酶荧光PCR检测结核分枝杆菌效能 收集的344份痰样本中有7例培养阳性，菌种经PNB法鉴定为非结核分枝杆菌，两种PCR荧光探针法检测均为阴性。为便于讨论将这7例排除，另有12例诊断不明也被排除，共325例病例纳入统计分析。以MGIT960液体培养为标准，KOD DNA聚合酶荧光PCR检测MTB敏感度为92.31%(144/156)和特异度为86.39% (146/169)；在237例涂片阴性患者中，敏感度和特异度分别为 84.21%(64/76)和88.48%(146/165)，见表5。

表5 与MGIT960液体培养比较，KOD DNA聚合酶荧光PCR检测结核分枝杆菌效能

2.5.3两种荧光PCR与细菌学方法检测肺结核病例结果比较 在涂阳、培养阳性、及任一种细菌学方法阳性肺结核患者中，KOD DNA聚合酶荧光PCR法敏感度为100%、92.31%、92.50%，Taq DNA聚合酶荧光PCR法敏感度为100%、89.74%、90.00%，差异均无统计学意义(χ2=0.628、0.626,均P>0.05)；在涂阴、培养阴性、及两种细菌学方法均为阴性肺结核患者中，KOD DNA聚合酶荧光PCR法敏感度为61.90%、37.10%、32.76%，Taq DNA聚合酶荧光PCR法敏感度为61.10%、41.94%、37.93%，差异均无统计学意义(χ2=0.16、0.304、0.340,均P>0.05)，见表6。

3 讨 论

结核病的早期诊断对于病人获得及时治疗和疫情的防控具有十分重要的意义。近年来兴起的分子生物学检测技术具有快速、灵敏度高等优点，已逐渐成为我国结核菌实验室常规检测项目，并作为肺结核诊断依据之一[5]。PCR荧光探针法是目前国内结核菌实验室使用最为广泛的分子生物学方法之一，而其中又以TaqMan荧光探针法最为常见[7]。该方法检测快速、灵敏，但也存在易污染、操作复杂、对人员和实验室环境要求高等缺点。

本研究应用的PCR 荧光探针法采用的是 KOD DNA聚合酶，该酶具有热稳定性好、DNA合成速度快、合成错误率低的特点，与Tag DNA聚合酶比较，该酶在95 ℃可稳定12 h，而Tag DNA聚合酶只能稳定1.6 h；在DNA合成速率和错误率方面，KOD DNA聚合酶为100 bp/s，错误率仅为0.1%，Tag DNA聚合酶为54 bp/s，错误率为4.8%，采用KOD DNA聚合酶，可以使1次循环的时间从原来的几分钟缩短为几十秒[8-9]。本研究中PCR使用QProbe为探针，QProbe通过混合特定的排列，将具有荧光消失这一特征的荧光色素作为标识的探针。利用这一特征，就无需使用插入DNA嵌入剂等其它双链核酸结构的色素，也无需使用会引起FRET现象的2种探针，而是使用在一种荧光物质中作出标识的探针，在不会阻碍高速扩增的同时，能够特异性地检测出目标核酸排列[10]。另外，本研究PCR扩增的目标基因为DNA J基因。目前国内外研究较多的目标基因主要有插入序列IS6110(inSertion sequence 6110，IS6110)、16S核糖体RNA基因(16s ribosomal RNA，16srRNA)等。有研究发现亚洲地区流行的部分MTB菌株中，IS6110拷贝数较少或无此插入序列[11]，这可能导致检测阳性率降低；另有研究发现一些NTM菌种存在与IS6110具有同源性的基因片段，如龟分枝杆菌(M.chelonae)[12]，会出现假阳性结果。16SrRNA基因在多达100余种的分枝杆菌属(Mycobacterium)中也存在交叉反应，也会导致检测的假阳性结果。DNA J基因菌种特异性高，国外研究表明应用该基因检测MTB不会与不同种类分枝杆菌产生交差反应，具有较好的灵敏度和特异度[4]。

本研究同时使用MGIT960液体培养法、Taq DNA聚合酶荧光PCR和KOD DNA聚合酶荧光PCR荧光探针法3种方法检测肺结核疑似患者的痰样本，结果显示两种荧光PCR检测结果具有较好的一致性(Kappa=0.871>0.75)。由表3结果可见，以临床诊断结果为标准，3种检测方法的Kappa值在0.624～0.683之间，均接近较好水平，而其中KOD DNA聚合酶荧光PCR的一致性最好。在检测敏感度方面，KOD DNA聚合酶荧光PCR达到76.61%，与国外文献报道的荧光PCR70.4% 的检测敏感度相近[13]，研究结果显示本法敏感度远高于涂片镜检(38.53%)，与液体培养法无差别(P=0.229>0.05)，虽然理论上PCR的敏感度应高于传统的培养法，但国内外均有PCR法敏感度与培养法无差别的报道[14-15]，这可能与PCR试剂设计的检测敏感度及痰中存在PCR抑制因子在结核菌量低时影响检出率有关[16]；在特异度方面KOD DNA聚合酶荧光PCR达到100%，未纳入统计的7例NTM标本，检测结果也均为阴性，显示该方法选用的目标基因DNA J基因具有较好的种属特异性。表5结果显示，以液体培养试验结果为金标准，KOD DNA聚合酶荧光PCR检测敏感度和特异度分别为92.31%和86.39%，特别在涂阴患者中敏感度达到84.21%，略高于Hida等[17]人报道的敏感度(72.7%)。另外，本研究显示在涂片阴性、培养阴性和双阴性肺结核患者中，KOD DNA聚合酶荧光PCR的阳性率分别达到了61.90%、37.10%、32.76%，该结果表明KOD DNA聚合酶荧光PCR检测MTB 的高灵敏度极大提高了肺结核尤其是菌阴肺结核的检出率，为结核病的早期诊断提供实验室依据。

本研究方法配套使用的PCR分析系统具有全自动核酸提取及定量荧光PCR分析的功能，且系统为全封闭式。与传统荧光定量PCR法相比，该方法全过程仅需60 min大大缩短了检测时间，相较于世卫组织推荐的Genexpert系统也快了近1倍[18]。

本方法操作简便，标本仅需NALC-NaOH处理后即可上机，对实验人员操作熟练度要求低，同时全封闭系统极大降低了生物安全和实验污染风险，不需要对实验区域进行分区。但本法尚不能检测耐药基因，是今后需要改进的地方。综上，KOD DNA聚合酶荧光PCR检测MTB具有敏感度高、特异度高、操作简便、快速等优点，适合各级结核病实验室开展。

利益冲突：无