口腔鳞癌叶酸表达的临床病理分析

杨艳 陈盛 蒲玉梅 王育新

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)，简称口腔鳞癌，是口腔颌面-头颈部最常见的上皮源性恶性肿瘤。除手术治疗外，化疗是治疗OSCC的主要方法之一，尤其对于晚期OSCC患者或不能耐受手术治疗的患者，化疗可能延长患者生命。

目前非靶向化疗存在靶向性差，系统毒性高等缺点，以VEGF、EGFR等为靶点的主动靶向化疗逐渐受到临床医师和患者的关注[1-3]。叶酸受体(folate receptor，FRα)在正常组织中往往低表达，而在卵巢癌、肺癌等大多数肿瘤组织中高表达，因此以FRα为靶点的靶向化疗成为研究热点[4-6]。目前OSCC中叶酸表达仍不明确，本研究通过分析不同分型、临床分期、肿瘤浸润方式中FRα表达并分析其与患者预后相关性，为FRα靶向治疗OSCC提供临床病理学参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取南京大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科2012 年1 月～2013 年12 月就诊并行手术治疗的OSCC患者，甲醛固定石蜡包埋组织标本95 例，同一患者术后切缘病理证实为正常口腔黏膜组织标本作为对照组。所有患者术前均未接受放化疗、激素及其他辅助治疗，术后诊断均经病理证实。

1.2 临床随访

对95 例OSCC患者均进行随访，随访时间最短为6 个月 , 最长为80 个月, 平均随访时间31.3 个月。分析所选患者性别、发病部位、淋巴结转移情况、病理分级对患者预后的影响及与叶酸表达之间的相关性。

1.3 免疫组化

采用兔抗人FRα单克隆抗体(Abcam，英国)。以1∶100稀释的山羊IgG为阴性对照。采用免疫组化方法对石蜡包埋的OSCC标本进行免疫组化分析。具体方法如下：二甲苯脱蜡后，梯度乙醇水化，抗原修复方法是：EDTA修复液(pH 9.0)的电磁炉中加热，煮沸后计时15 min，然后冷却至室温(约20 min)。磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗后，山羊血清封闭10 min，不洗，甩干，以1∶100稀释的抗FRα一抗4 ℃冰箱孵育过夜，用PB冲洗。然后用K5007二抗(DAKO，丹麦)在室温下孵育20 min，PBS冲洗3 次，每次3 min，DAB显色，镜下控制显色时间。最后用苏木精复染1 min，自来水冲洗1 min，盐酸乙醇分化3 s，自来水冲洗3 min，1%碳酸锂蓝化，自来水冲洗3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明封片，完成免疫组化。

1.4 FRα阳性判断标准

所有组织切片均由一名病理学家评估。切缘病理证实为正常口腔黏膜上皮亦被评估并分级。FRα阳性表达为发生特征性的膜和细胞质免疫反应，胞浆内出现棕黄色颗粒。采用免疫组化评分法进行分析。依据细胞染色强度分为未染色(0 分)、淡黄色(1 分)、棕黄色(2 分)、棕褐色(3 分)。随机选择5 个视野，依据阳性细胞所占比例分为0%～1%(0 分)、2%～10%(1 分)、11%～50%(2 分)、51%～80%(3 分)、81%～100%(4 分)[7](图 1)。

1.5 统计学方法

采用Mann-Whitney秩和检验比较不同性别，不同病理分级，不同浸润方式，不同T分期，不同部位，及有无淋巴结转移患者的FRα表达情况。采用Kaplan Meier曲线和log-rank检验将各组患者FRα表达与DFS、OS进行相关性分析。P<0.05在所有分析中被认为具有统计学意义。

图 1 FRα在OSCC组织标本中的表达(IHC)

2 结 果

2.1 临床病理资料

对95 例OSCC患者病理标本进行分析。其中68 例(71.6%)病理证实无颈部淋巴结转移，27 例(28.4%)存在颈部淋巴结转移。年龄范围29～82 岁，中位年龄60.25 岁，男女比例约1.26∶1。病理分级为低分化4 例(4.2%)，中分化59 例(62.1%)，高分化32 例(33.7%)。肿瘤浸润方式(worst pattern of invasion,WPOI)： WPOI 1～3 级66 例(69.5%)，WPOI 4～5级29 例(30.5%)。T分期：T 1-2为21 例(22.1%)，T3为63 例(66.3%)，T4为11 例(11.6%)。肿瘤原发部位：舌40 例(42.1%)，颊21 例(22.1%)，口底9 例(9.5%)，牙龈19 例(20%)，腭部6 例(6.3%)。

2.2 临床随访资料

所有OSCC患者中位生存时间为3.89 年。3 年和5 年的总生存率(overall survival,OS)分别为72.6%和71.5%，3 年和5 年的无病生存率(disease-free survival,DFS)分别为74.7%和73.1%。

2.3 FRα的表达情况及与OS，DFS的相关性

所有OSCC患者叶酸表达情况分为3 组：FRα 0-1为低表达组，FRα 2-3为中表达组，FRα4为高表达组。低表达组为40 例(42.1%)，中表达组46 例(48.4%)，高表达组(9.5%)(图 2)。

图 2 OS及DFS与WPOI分级和FRα表达差异的相关性

表 1 临床病理资料与叶酸表达相关性

FRα表达在男女间无显著性统计学差异(P=0.304)，肿瘤原发部位间无统计学意义(P=0.846)，而在病理高、中、低分化间(P=0.017)，浸润方式间(P=0.036)，T分期(P=0.002)，术前淋巴结转移患者与非转移患者间有统计学差异(P=0.005)(表 1)。

FRα表达量与5 年OS呈负相关，FRα高、中、低表达分别为33.4%、79.4%、90.1%(P=0.000 3)；FRα表达量与5 年DFS方面也呈负相关，FRα高、中、低表达分别为44.7%、82.9%、69.5%(P=0.033 6)。

3 讨 论

叶酸在细胞快速分裂和生长中起着重要作用，如参与嘌呤、嘧啶的合成，进一步合成DNA和RNA；参与多种氨基酸的代谢等。FRα能够以胞吞的形式将叶酸运输到细胞内，癌细胞为了满足自身合成的需要，可能通过上调FRα的表达量提高其对叶酸的摄取能力。FRα分为3种亚型FRα、FRβ 和 FRγ。FRα表达于大部分癌症组织的上皮细胞中，而绝大多数正常细胞(除肾脏、胎盘)其表达量极低；FRβ在非上皮组织的癌症细胞中过表达(髓细胞性白血病、恶性肉瘤)，而在造血细胞和非上皮细胞(脾脏、胸腺)表达量不高；FRγ在人体内分布较少。研究表明FRα过表达的癌症包括卵巢癌、肺癌、肾癌、子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌等[8-10]，FRα已成为肿瘤靶向治疗的靶点。然而，OSCC的FRα研究少见且具有争论[11-12]。

本研究表明，FRα在OSCC中有相当比例的表达，且其FRα表达量与病理分级，WPOI，肿瘤分期及淋巴结转移之间存在相关性，这表明FRα表达可能是一种更具侵袭性的肿瘤表型的标志物。

影响OSCC患者OS和DFS的因素包括病理分级、WPOI、肿瘤临床分期、淋巴结转移情况、肿瘤厚度等。本研究将叶酸表达量与患者临床病理资料分别行相关性分析，发现FRα表达在性别与肿瘤原发部位之间无统计学意义，而在病理高、中、低分化之间(P=0.017)，浸润方式之间(P=0.036)，T分期(P=0.002)，术前淋巴结转移患者与非转移患者之间有统计学差异(P=0.005)，由此证明叶酸表达与肿瘤细胞增殖及转移存在相关性。分析原因，考虑叶酸是细胞快速分裂和生长中所必须，因此肿瘤细胞在增殖分化、转移中需要大量的叶酸来参与能量代谢。Ki-67人体中增生细胞核中的标志性抗原，能比较准确地反映细胞的增殖情况。有文献证实叶酸表达与Ki-67存在高度相关性[13]，由此证明叶酸也可作为一种重要的观察癌细胞增殖及转移能力的指标。

以FRα为靶点的靶向给药策略，在新型抗肿瘤药物的研究和开发中已显示出广阔的应用前景。因此了解FRα在OSCC和其他恶性肿瘤中的存在和表达水平可以为更好的治疗提供依据。然而国内外对于OSCC组织中FRα的表达情况报道少见。Saba等[11]报道了FRα表达于头颈鳞癌中，且FRα高表达与较差预后相关，而Sun等[12]发现在头颈鳞癌病理标本中，巨噬细胞FRα高表达，癌细胞为低表达甚至不表达。由此可见，FRα在头颈鳞癌的表达情况存在争论，使得FRα靶向化疗在OSCC中的应用缺乏临床依据。本研究中发现在OSCC中FRα0不表达占13.6%、FRα1占28.4%，而FRα2-4占57.8%，且其表达高低与肿瘤病理分化程度、浸润方式、淋巴结转移存在正相关性。进一步分析叶酸表达与OSCC生存预后的关系，发现FRα表达与患者的OS和DFS亦存在相关性，FRα高表达提示患者预后较差，因此FRα表达量或许可以作为一个判断临床预后的免疫组化指标。确定FRα在OSCC中的表达情况，不仅可以预测OSCC预后，而且为OSCC精准治疗提供了可能。

受体介导的肿瘤靶向成像和治疗是以肿瘤细胞表面特异性的受体为靶点，以受体为对应的配体结合物为载体，利用两者特异性反应，最终实现肿瘤主动靶向。在纳米药物输送抗肿瘤药物的靶向剂中，FRα是一种常用且有效的靶向受体[14]。FA和FRα(Kd～0.1 nmol/L)之间的高亲和度将会导致FRα过表达的癌细胞增加对治疗药物的摄取[15]。Zhu等[16]应用叶酸靶向的聚合物囊泡负载紫杉醇和阿霉素联合化疗肝细胞癌，在FA高表达的BEL-7404肝癌细胞株造模的裸鼠上获得极佳的抗肿瘤效应。Van等[17]利用FRα靶向脂质体纳米复合物治疗乳腺癌，在动物模型亦获得成功。Wang等[18]制备叶酸靶向温度敏感磁性脂质体成功治疗卵巢癌。上述研究均证实FA靶向肿瘤特异性聚集，减少了对正常细胞毒性，改善了化疗药物的生物利用度。

本研究结果提示以FRα介导的靶向治疗OSCC具有病理学基础。