茶树精油对变异链球菌抑菌浓度及效力的探究

宋玉梦 周红艳 黄鑫 梅予锋

变异链球菌是公认的致龋菌，可通过黏附、产酸和耐酸作用破坏牙体组织而形成龋坏。目前国内外主要通过应用氟化物和氯己定等化学合成药物抑制变异链球菌的生长以达到防治龋病的目的，但因存在稳定性、耐药性、毒副作用等问题，致使寻找安全有效的抗菌药物成为龋病预防的当务之急，目前已有一些植物提取物作为抗菌药抑制致龋菌的生长[1-2]。近年来，有研究证实茶树精油(tea tree oil,TTO)可以有效抑制牙菌斑的形成，起到龋病预防的作用[3]。但有效抑菌浓度、杀菌时间，抑菌效果及稳定性等均未见报道。本研究拟初步探究TTO对变异链球菌的最小抑菌浓度、最小杀菌浓度，评价不同浓度TTO对变异链球菌抑菌率，探索TTO杀菌时间和杀菌效果维持时间，为TTO的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

变异链球菌ATCC-25175由南京医科大学口腔研究所提供；茶树精油(TTO,纯度为98%，南京康满林化工实业有限公司)；牛心脑浸液培养基(BHI，Difco，美国)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma，美国)；洗必泰(福建维真园医药科技有限公司)；厌氧培养箱(Bugbox M，英国)；超净工作台(SG403，贝克公司,美国)；光吸收型酶标仪(Spectramax190，MD,美国)。

1.2 研究方法

1.2.1 细菌复苏和培养 取-80 ℃冻存的变异链球菌ATCC25175标准菌株，室温下解冻后接种于BHI 琼脂培养基，37 ℃恒温厌氧箱(80%N2，10%CO2，10%H2)内复苏24 h，挑取单克隆菌株继续培养24 h后制备菌悬液，用PBS将细菌浓度调整为1×106CFU/ml，4 ℃备用。

取冻存菌液20 ml置于锥形瓶内，37 ℃厌氧培养，每隔0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24 h 取1 ml液体，离心后PBS重悬，取200 μl置于96 孔板内，用微孔板分光光度计测吸光度值(A=600)。绘制细菌生长曲线。

1.2.2 TTO对游离变异链球菌生长的影响

1.2.2.1 TTO对变异链球菌抑菌环的影响 采用改良的牛津杯法[4]检测TTO对变异链球菌抑菌环大小。取对数生长期菌液，浓度调整为1×106cfu/ml[5]，取100 μl涂平板，在同一培养皿内放置5 个自制牛津杯，各孔分别加入100 μl TTO，浓度为20%、10%、5%，另设2 个对照组，分别加入100 μl 0.2%氯己定(CHX)，100 μl灭菌0.5%Tween-80。4 ℃静置2 h，37 ℃厌氧培养24 h观察结果。实验重复3 次。

1.2.2.2 TTO对变异链球菌的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC) 根据CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)标准化指导方法[6]，采用标准微量肉汤稀释法进行MIC的测定。96 孔板内第1至9列每孔中加入菌悬液100 μl， BHI培养液100 μl。第一孔内加入TTO终浓度为2%，依次进行二倍稀释至终浓度0.031 25%，阳性对照组含0.2%CHX，阴性对照组不加任何药物，空白对照组加200 μl灭菌BHI培养液。37 ℃厌氧培养24 h。24 h后肉眼观察，尚澄清孔所对应的最低药物浓度为MIC。选取大于MIC浓度各组，每组随机选一孔，取10 μl按1∶10 000稀释，100 μl转移至培养皿中，37 ℃厌氧培养48 h，菌落计数，在平板上未观察到菌落生长的浓度为MBC[7]。每个实验组均设5 个平行组，实验重复3 次。

1.2.2.3 TTO在对变异链球菌的抑菌率 将配置好的菌液分为7 组，用BHI将菌液浓度调整为为1×106cfu/ml，加入TTO终浓度分别为2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0.03125%，阳性对照组加入0.2%CHX，阴性对照组不加任何药液。37 ℃厌氧培养12、24、48 h后分别取样，离心，PBS洗菌3 次，1 ml PBS重悬，加入96 孔板，MTT染色，避光培养4 h，离心，弃上清，加DMSO，溶解15 min后测吸光度，A=570，计算抑菌率。

抑菌率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%

1.2.2.4 TTO对变异链球菌杀菌时间 将制备好的菌液分别置于5 个锥形瓶内，加入TTO，终浓度为4MBC、2MBC、MBC、MIC、1/2 MIC，阳性对照组加0.2% CHX，阴性对照组不加任何药物。0、15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h后取样，离心，弃上清。PBS洗菌3 次后重悬，4 ℃暂存，取样结束后将所取样本加入96 孔板内，MTT进行染色，方法同上。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 变异链球菌生长曲线测定

变异链球菌生长曲线如图 1，根据实验结果可知，变异链球菌生长周期为24 h，生长8～12 h时处于对数增长期。

图 1 变异链球菌生长曲线

2.2 TTO对游离变异链球菌生长的影响

2.2.1 TTO对变异链球菌抑菌环的影响 实验结果如表 1，5%TTO组，10%TTO组与阳性对照组比较，差异有统计学意义(t5%=14.190，P5%=0.000；t10%=8.093,P10%=0.000)。20%TTO组与阳性对照组比较差异无统计学意义(t=1.497,P=0.815)。

表 1 TTO 对变异链球菌抑菌环大小

2.2.2 TTO对变异链球菌的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC) TTO浓度为0.125%时，自然光下肉眼见96孔板澄清无浑浊，MIC为0.125%，将澄清孔按1∶10 000比例稀释后涂板，0.25%TTO未见菌落生长，MBC为0.25%。

2.2.3 TTO对变异链球菌的抑菌率 24 h内，0.25%及以上浓度TTO均能完全杀灭细菌，抑菌率为100%。0.125%TTO抑菌率为90.97%±0.77%，69.94%±4.46%与对照组相比，差异无统计学意义(t12=7.390,P12=0.947；t24=4,627,P24=0.219)。0.06%TTO抑菌率为34.75%±9.96%,47.31%±5.60%，与对照组差与有统计学意义(t12=8.926,P12<0.01；t24=10.601,P24=0.045)。0.03%TTO抑菌率为33.21%±1.36%，35.17%±5.80%，与对照组相比差异有统计学意义(t12=58.196,P12<0.01；t24=13.828,P24=0.026)。

图 2 不同浓度TTO在不同时间下对变异链球菌抑菌率

48 h时，0.5%TTO可完全杀灭细菌，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。浓度小于0.5%时，抑菌率分别为：68.63%±0.47%、61.72%±1.76%、46.72%±11.56%，与对照组相比差异无统计学意义(t0.25=1.715,P0.25=0.068；t0.125=7.30,P0.125=0.416；t0.06=1.01,P0.06=0.133)。0.03%TTO抑菌为43.15%±3.66%，与对照组相比差异有统计学意义(t0.03=1.819，P0.03=0.046)(图 2)。

2.2.4 TTO对变异链球菌的杀菌时间 当TTO浓度大于等于0.25%时，均可在1 h内完全杀灭细菌，0.125%TTO可在1 h内抑制细菌生长，此后12 h内各组均未见明显的细菌增殖现象。0.06%TTO在4 h内达到抑菌效果，此后见细菌增殖现象(图 3)。

图 3 不同浓度TTO杀灭变异链球菌的工作时间

3 讨 论

龋病作为一种危害人类口腔健康最常见的疾病，对口腔健康造成较大威胁。变异链球菌作为主要的致龋菌能在牙齿表面形成牙菌斑生物膜导致龋病的发生[8]。目前，控制变异链球菌生长的药物主要为化学性药物，其中氟化物和氯己定的应用最为广泛。氟化物可以抑制变异链球菌生长，然而研究发现短暂的氟化物处理并不能维持对生物膜中变形链球菌的抗酸活性，损伤可以随时间恢复[9]。此外，氟化物的广泛应用易引起耐氟菌株产生[10]，并且氟浓度稳定性较差，过多或不当使用可导致人体慢性氟中毒,产生氟斑牙、氟骨症[11-12]。氯己定作为一种广谱抗菌药物被广泛应用于口腔细菌的控制，但长期使用广谱抗菌剂易引起口腔菌群失调、使细菌产生耐药性、着色等问题。此学者们将目光转移到安全性更高的植物性抗菌药。

TTO是从互叶白千层植物新鲜枝叶中提取得到的淡黄色液体，主要成分是单萜烯、醇类及倍半萜类化合物，约占总量的70%以上，其中4-萜烯醇和1,8-桉树脑是茶树精油抗菌活性的物质基础[13]，主要通过破坏膜结构，抑制微生物呼吸途径中线粒体酶、脱氢酶活性，影响细胞呼吸作用，干扰胞内大分子物质活性等形式达到杀菌作用[14]。近年来，有研究证实TTO能控制菌斑生长，抑制变异链球菌活性[15-16]，但现存的实验对TTO抑制变异链球菌的抑菌浓度、杀菌时间及作用效果等均未做出明确解释，使得无法将TTO投入到临床使用。本实验探究了TTO对变异链球菌的抑菌效果，最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，研究不同浓度TTO对变异链球菌的抑菌率，并探究TTO的杀菌时间，为TTO精油的临床应用提供理论依据。

本实验利用琼脂盘扩散实验证明随着浓度的增加，TTO对变异链菌抑菌环直径呈剂量依赖性增大。20%TTO抑菌环直径为(20.26±3.64) mm,与阳性对照组(22.11±1.85) mm作用效果相当。根据文献可知，植物精油的抗菌活性可分为三级：抑制区≤12 mm，活性弱；12 mm<抑制区<20 mm，活性中等；抑制区≥20 mm，活性强[17]。因此20%TTO对变异链球菌抗菌活性较强。然而TTO溶解性差，挥发性较高[13],且在琼脂培养基中扩散性受到时间，温度等影响，抑菌效果会被低估，因此选择后续实验对其抑菌效果加以佐证。

标准肉汤稀释法得出TTO对变异链球菌的MIC为0.125%，MBC为0.25%，与Chandrdas等[18]的研究结果基本一致。抑菌率实验可知，当TTO浓度大于等于MBC时，抑菌率为100%，与0.2%CHX效果相当，当TTO浓度小于MBC时，抑菌率呈现浓度依赖性趋势，随着浓度的降低，TTO抑菌率逐渐降低。此外，TTO抑菌率也受时间的影响，高浓度下(>0.25%)48 h内均可达到完全杀菌效果，0.25%TTO在48 h时已无法达到完全杀菌作用，0.125%TTO抑菌率也出现明显降低，较低浓度(0.06%、 0.03%)抑菌效果随时间变化不明显。阳性对照组0.2%CHX在48h时杀菌效果明显降低，无法起到杀菌作用。由此可知当0.5%TTO时杀菌效果较好，杀菌效果维持时间较长，可作为临床使用的参考浓度。

通过杀菌时间实验评估抗菌活性，验证细菌杀灭和再生长的速率，杀菌范围和时间，此方法是体外研究杀菌研究最常用的模型之一[19]。实验证实TTO作用所需时间与药物浓度没有明显相关性，各浓度在药物作用1 h后效果均达到最佳。与氯己定相比所需时间较长。猜想TTO作为植物性抑菌药物，作用效果温和，作用时间略长，但作用效果更稳定。此外，0.2%CHC杀菌过程中产生大量黄褐色沉淀黏附在管壁上难以清除，但实验组并未出现此情况，因此推测TTO能有效避免牙齿着色的问题。

综上所示，TTO作为一种杀菌剂，能有效抑制变异链球菌活性，起到杀灭变异链球菌的作用，杀菌所需浓度较低，作用温和，效果稳定。但TTO对变异链球菌结构和形态的影响，以及其生物安全性并未明确，是后续实验的研究方向。