干扰素α对乙型肝炎小鼠病理形态学及TGF-β1、ACT-A表达影响

2020-12-05刘晓倩

中国医学装备 2020年11期

刘晓倩乔珺张蕾张新*

由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的乙型肝炎(简称乙肝)在世界范围内具有极高的发病率，我国是乙肝发病大国，且一直是突出的公共卫生问题[1]。干扰素α(interferon alpha，IFN-α)具有抗病毒及抗肿瘤的调节作用，在乙肝治疗中应用较为广泛[2]。此外有研究发现，IFN-α的其他机制也可能具有治疗乙肝及肝纤维化的作用。刘娜等[3]研究结果显示，IFN-α可通过调节免疫提高对乙肝的疗效。同时免疫炎性水平异常也是影响肝纤维化的重要因素，提示IFN-α也可能具有抑制乙肝纤维化的作用[4]。

转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)及活化素A(activins A，ACT-A)均属于TGF-β超家族，具有调节细胞生长和分化的作用。有研究显示，TGF-β1可通过调节肝星状细胞促进肝纤维化，并且TGF-β1可能预示着更严重的肝组织损伤和纤维化程度[5-6]。ACT-A是一种由性腺分泌的肽类激素，具有调节纤维化的作用[7]。本研究主要分析IFN-α对乙肝小鼠肝组织病变及纤维化的影响，并检测TGF-β1及ACT-A的变化，为将IFN-α更好应用于治疗乙肝提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级饲养条件下BALB/c雌性小鼠共30只，鼠龄为8周，均购自中国动物实验中心(Laboratory Animal Center)；将生理状况一致的健康30只小鼠分为3组，每组10只，分别为对照组、模型组和IFN-α组。

1.2 仪器与试剂

(1)仪器设备：采用ARCHITECT i2000SR酶标仪(美国雅培公司)；ABI 7500 qPCR检测系统(美国Life technologies公司)；BX63电动荧光显微镜(日本Olympus公司)。

(2)试剂：HBV及Hank调试剂(北京动物传染病实验研究中心)；pKCMvint.IFN-α-2a及阴性对照质粒pKCMvint(德国埃森医院病毒研究所)；血清谷氨酸转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、门冬氨酸转移酶(aspartate transferase，AST)、HBV血清标志物HBeAg、HBsAg及IFN-α酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒均购自北京乐博公司；苏木素-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色和Masson染色试剂盒均购自武汉华美公司；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；逆转录cDNA试剂盒及SYBR Green PCR Master Mix qPCR(定量PCR，quantitative qPCR)试剂盒(瑞士Roche公司)；抗体(美国Abcam公司)；膜聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美国Bio-Rad公司)。

1.3 干预方法

模型组和IFN-α组根据参考文献[8]建立HBV感染模型，使用Hank调试剂将HBV稀释至1×106个/ml，然后经小鼠尾静脉注射HBV溶液，注射剂量为10 ml/kg。对照组注射等剂量溶剂。IFN-α组[9]通过高压尾静脉注射pKCMvint.IFN-α-2a，每只10 μg，每2周一次，其中模型组注射等剂量的阴性对照。注射后第28 d检测各指标。

1.4 实验方法

1.4.1 ELISA检测

注射后第28 d，采用ELISA检测AST、ALT、HBeAg、HbsAg、IFN-α、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)的水平。对小鼠进行眼眶取血，利用离心设备，以6000 r/min的速度离心10 min，收集上层血清，通过磷酸缓冲液将其稀释20倍后，根据ELISA试剂盒说明书加入试剂，检测血清中HBV标志物HBeAg、HBsAg及IFN-α水平。

1.4.2 染色

注射后28 d将小鼠麻醉后处死，取出肝组织，室温固定并包埋。将样品切成4 μm厚的均匀薄片，进行脱蜡及水合，分别通过HE及Masson试剂进行染色，显微镜下观察肝组织形态和纤维化程度。

1.4.3 RT-qPCR检测

使用Trizol 试剂获得肝组织中总核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)，并检测RNA浓度和纯度。使用逆转录cDNA试剂盒逆转录1 μg RNA用于合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒和RTqPCR检测系统。进行qPCR实验(在95 ℃/10 min，40个循环，94 ℃/15 s，60 ℃/1 min，60 ℃/1 min，4 ℃保存)。比较循环阈值(ΔΔCt)用于分析RNA的表达。磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和序列(U6)用于标准化。

1.4.4 蛋白印迹方法(Western blot)

采用Western Blot检测肝组织中TGF-β1和ACT-A蛋白水平。在液氮的保护下裂解肝组织，在12000 rpm，4 ℃下离心15 min收集上清液，使用蛋白检测方法(bicinchoninic acid，BCA)确定蛋白质浓度。十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)(10%)电泳后进行PVDF膜转及封闭。加入一抗后在室温下振荡2 h，后在4 ℃环境下孵育过夜，加入二抗。使用GAPDH作为内参。

1.5 统计学方法

使用SPSS19软件对数据进行统计分析，单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)评估组间差异，计量资料采用均值标准差()表示，两两比较使用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况比较

对照组小鼠饮食、活动及排泄正常，皮毛有光泽且精神状态正常。模型组小鼠出现明显的精神萎靡，活动及饮食减少，部分出现腹水。IFN-α组的小鼠饮食和活动基本正常，皮毛较柔顺，无腹水出现。

2.2 小鼠血清HBV标志物及IFN-α水平比较

模型组及IFN-α组小鼠血清中可检测出明显的HBV标志物HBeAg和HBsAg，并且IFN-α组血清HBeAg和HBsAg水平显著低于模型组(t=6.132，t=5.986；P＜0.05)。模型组和对照组IFN-α水平比较差异无统计学意义，IFN-α组的IFN-α水平显著高于模型组(t=4.812，P＜0.05)，见表1。

2.3 小鼠肝功能水平比较

模型组小鼠血清肝功能指标ALT和AST显著高于对照组(t=6.115，t=6.548；P＜0.05)，IFN-α组的ALT和AST水平显著低于对照组(t=4.661，t=5.018；P＜0.05)，见表2。

2.4 小鼠肝组织病理学形态变化

对照组小鼠的肝组织中细胞形态完整，排列紧密，细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构完整且清晰。模型组小鼠的肝细胞出现显著形变，细胞排列异常，出现假肝小叶，并且出现炎症反应。IFN-α组小鼠的肝组织损伤程度较模型组显著缓解，炎症反应较轻，细胞排列基本紧密。各组小鼠肝组织病理学形态见图1。

2.5 小鼠肝组织纤维化情况比较

Masson染色检测中灰蓝色为纤维组织，结果显示对照组小鼠肝组织未发现明显的纤维化现象，而模型组小鼠的肝组织出现大量的纤维化染色，IFN-α组小鼠的肝组织基本正常，并且仅有少量的纤维化染色，见图2。

2.6 小鼠炎性因子比较

模型组小鼠血清TNF-α和IL-6水平显著高于对照组(t=5.771，t=6.238；P＜0.05)，IFN-α组的TNF-α和IL-6水平显著低于模型组(t=5.823，t=5.339；P＜0.05)，见表3。

表1 各组小鼠血清HBV标志物和IFN-α水平比较()

注：表中IFN-α为干扰素α；HBeAg、HBsAg均为乙肝病毒血清标志物

表2 各组小鼠血清ALT和AST水平比较(U/L，)

注：表中IFN-α为干扰素α；ALT为血清谷氨酸转移酶；AST为门冬氨酸转移酶

图1 HE染色检测各组小鼠肝组织病理学形态(×400)

图2 Masson染色检测各组小鼠肝组织纤维化情况(×400)

表3 各组小鼠血清TNF-α和IL-6水平比较(μg/L，)

注：表中IFN-α为干扰素α；TNF-α为肿瘤坏死因子α；IL-6为白细胞介素6

表4 各组小鼠肝组织中TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平比较()

注：表中IFN-α为干扰素α；TGF-β1为转化生长因子β1；ACT-A mRNA为活化素A信使核糖核酸

2.7 小鼠肝组织TGF-β1及ACT-A表达水平比较

模型组小鼠肝组织中TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平显著高于对照组(tTGF-β1=5.061，t=5.018；tACT-A=4.718，t=4.059；P＜0.05)，IFN-α组的TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平显著低于模型组(tTGF-β1=6.224，t=4.389；tACT-A=5.973，t=5.389；P＜0.05)，见表4及图3。

图3 各组小鼠肝组织中TGF-β1和ACT-A蛋白水平蛋白印迹电泳图

3 讨论

我国是乙肝发病大国，该疾病为患者、家庭和社会带来了极大的负面影响。有研究发现，慢性HBV可持续的损伤患者肝细胞，长期可能造成肝纤维化甚至肝硬化。有效清除病毒缓解肝损伤是治疗乙肝的重要途径。

IFN-α最初在60年前被发现，具有干扰病毒复制的能力，有研究已证明IFN-α可通过干扰素刺激基因影响HBV生命周期的多个步骤以抑制HBV复制[10]。此外，IFN-α还具有免疫调节活性，可调节对HBV感染的免疫反应促进HBV的清除[11]。临床研究已发现IFN-α可用于治疗HBV感染，但仍有部分患者对IFN-α反应不佳，在治疗48周后，只有20～40%的患者出现HBeAg血清转化，可能与不同的HBV基因型有关[12]。但也有研究显示IFN-α具有治疗乙肝的作用，并且具有一定的安全性[13]。Li等[14]的研究显示对基线HBsAg水平较低的乙肝患者在早期使用聚乙二醇-IFN-α-2a治疗可能会在96周后出现HBsAg降低。本研究中，根据参考文献[8]通过经小鼠尾静脉注射HBV的方式建立乙肝模型，后根据参考文献的常用方法尾静脉注射pKCMvint.IFN-α-2a质粒以提高IFN-α的表达水平[9]。建模后通过检测小鼠血清中HBV标志物和IFN-α的水平发现模型组和IFN-α组的HBeAg和HbsAg显著高于对照组，并且IFN-α组的IFN-α显著高于模型组，而HBeAg和HbsAg显著低于对照组。结合过往研究，本研究结果显示了IFN-α对于感染HBV的小鼠具有显著的抑制病毒复制的作用。

为进一步研究IFN-α对乙肝小鼠肝损伤的影响，进一步分析了IFN-α对HBV感染小鼠模型病理形态学、血清炎性因子、TGF-β1和ACT-A水平的影响。结果显示模型组的肝功能指标AST、ALT和炎性因子TNF-α及IL-6显著高于对照组。IFN-α组的肝功能损伤程度和炎性因子水平显著低于对照组。对于模型组，HE染色也可观察到明显的组织损伤和炎性反应，Masson染色可观察到肝组织纤维化的加重，而IFN-α组的肝组织损伤程度和纤维化程度显著低于对照组。有临床研究显示，IFN-α具有调节HPV感染的宫颈癌患者的免疫应答和抑制炎性反应[15]。刘萍等[16]的研究显示，腺病毒肺炎婴幼儿外周血中促炎细胞因子的水平与IFN-α负相关。此外，李学艳等[17]发现，IFN-α可有效抑制疱疹性咽峡炎患者的炎性细胞因子的表达。而炎性因子也是诱发肝纤维化和肝硬化的主要因素。HBV感染可通过剪接特异性蛋白促进TGF-β1的表达并诱发肝癌的发生，而控制TGF-β1可延缓乙肝纤维化进展[18-19]。ACT-A是TGF-β超家族中的成员，感染引起的炎性反应也会引起ACT-a的升高，但关于ACT-A在乙肝肝损伤和肝纤维化中的机制尚不清楚。有研究发现，控制ACT-A的水平有助于缓解炎性反应保护肝组织[20-21]。