基于网络药理学探究桂枝茯苓丸治疗卵巢癌的潜在机制

何灿封， 肖志伟

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

卵巢癌(ovarian cancer，OC）是妇科常见的肿瘤，其年发病率在女性生殖系统肿瘤中排第3位，但复发率和死亡率位于女性生殖道恶性肿瘤首位。由于卵巢处于盆腔深部，病变早期无明显特异性症状，约70%患者就诊时已处于晚期，并伴有下腹不适、腹胀、食欲下降、消瘦、乏力等症状，多由肿块增大或盆腹腔大量积液所导致。手术和含铂方案化疗是目前OC治疗的主要手段，但仍有约70%的晚期OC患者会出现复发，并出现铂类药物耐药性[1]。复发性OC绝大多数无法治愈，其治疗多为在改善症状、提高生活质量目的下的姑息性治疗，故预防OC复发和逆转铂类耐药是目前临床中值得关注的问题。

卵巢癌属于中医学的“癥瘕”范畴。《诸病源候论》云：“其病不动者，直名为癥。若虽病有结癥而可推移者，名为癥瘕。”桂枝茯苓丸(Guizhi Fuling Pill）出自《金匮要略》，书中记载该方主治妊娠妇人宿有癥病。此方由桂枝、茯苓、桃仁、赤芍、牡丹皮等5味药组成，方中桂枝可温通经脉、活血通络，茯苓淡渗，可助行瘀血，桃仁破血行血、去瘀生新，而宿有癥块，久则化热，合赤芍、牡丹皮之微寒，可散瘀清热，诸药合用，有活血化瘀、缓消癥块之功。桂枝茯苓丸临床上广泛用于多种妇科肿瘤治疗，可发挥抑制肿瘤细胞增殖和转移、调节机体免疫和内分泌等作用[2，3]。

为了进一步探究桂枝茯苓丸治疗卵巢癌的潜在机制，本研究采用网络药理学方法筛选出桂枝茯苓丸有效成分及作用靶点，通过分子功能及通路富集分析等预测其作用机制，并使用分子对接技术研究核心成分及核心靶点的相互作用，以期为桂枝茯苓丸的临床应用提供依据，并为今后深入的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 收集桂枝茯苓丸的活性成分及靶点

从中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP， http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）中收集桂枝、茯苓、桃仁、赤芍、牡丹皮的成分，根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB）≥30%和类药性(drug-likeness，DL）≥0.18 筛选出活性成分[4，5]，并收集其相应靶点，删除不含有靶点的活性成分。通过通用蛋白质数据库(universal protein，Uniprot，http：//www.uniprot.org）将收集的靶点转化为基因名称，物种来源限制为人(“Homo sapiens”），删除物种来源不符合人的靶点。

1.2 收集桂枝茯苓丸治疗OC的潜在靶点

在人类基因数据库GeneCards(https：//www.genecards.org）检索“ovarian cancer”相关的疾病靶点，与TCMSP中收集到的桂枝茯苓丸靶点取交集后，最终获得桂枝茯苓丸治疗OC的潜在靶点。

1.3 构建中药-活性成分-靶点网络

使用Cytoscape软件(版本3.7.1）构建桂枝茯苓丸治疗OC的“中药-活性成分-靶点”网络，同时采用CytoNCA插件对该网络进行核心成分分析。连接度(degree，即节点间相连的路径数目，可体现节点的重要程度）值排名前3[6]的活性成分被认为是桂枝茯苓丸治疗OC的核心成分。

1.4 基因本体论(Gene Ontology，GO）分子功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

R语言中的clusterProfiler包是用于基因功能以及通路富集分析和可视化的软件包。在R语言(版本3.6.1）中调用clusterProfiler包对桂枝茯苓丸治疗OC的靶点进行GO分子功能和KEGG通路富集分析，筛选条件为P＜0.001。

1.5 构建蛋白质互作网络(protein-protein interaction，PPI）

将桂枝茯苓丸治疗OC的靶点导入蛋白互作网络分析平台STRING数据库(http：//string-db.org/），物种限制为人(“Homo sapiens”），构建蛋白质互作网络，下载该网络并导入至Cytoscape软件，采用CytoNCA插件对该网络进行核心靶点分析，degree值排名前3[6]的靶点被认为是桂枝茯苓丸治疗OC的核心靶点。

1.6 分子对接

使用分子对接技术探究桂枝茯苓丸核心成分与核心靶点之间的相互作用，具体为分别从PDB网站(http：//www.rcsb.org/）和pubchem网站(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载靶蛋白结构及核心成分的3D结构，使用AutoDock软件对蛋白结构进行去水、加氢及计算电荷处理后，以蛋白自带配体为中心构建对接口袋。如蛋白无自带配体，则使用CB-Dock在线分子对接网站(http：//cao.labshare.cn/cb-dock/）预测对接口袋[7]。确定对接口袋坐标参数后，使用AutoDock Vina软件进行分子对接和构象打分。使用R语言“heatmap”包根据对接结果分值绘制热图，并使用Pymol软件对上述对接结果中Vina对接分值最佳的受体-配体结构进行绘图。

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸的活性成分及作用靶点

在TCMSP中根据阈值OB≥30%和DL≥0.18含有靶点检索筛选桂枝、茯苓、桃仁、赤芍、牡丹皮的有效成分，去除重复成分后，共筛选出符合条件的活性成分43个，详见表1。将活性成分相应靶点的名称通过Uniprot数据库转换为基因名称，剔除重复及非人类靶点后，共获得212个潜在靶点。

2.2 桂枝茯苓丸治疗OC的潜在靶点

检索GeneCards数据库得到与OC相关的靶点共2 508个，与桂枝茯苓丸活性成分的作用靶点取交集后，最终获得桂枝茯苓丸治疗OC的潜在靶点共120个，详见图1和表2。

2.3 构建中药-活性成分-靶点网络

使用Cytoscape软件绘制桂枝茯苓丸治疗OC的“中药-活性成分-靶点”网络图，详见图2。该图直观反映了桂枝茯苓丸多成分、多靶点治疗OC的作用机制。CytoNCA插件分析表明，degree值排名前3的活性成分依次为Quercetin(槲皮素）、Kaempferol(山奈酚）、Baicalein(黄芩素），可认为是桂枝茯苓丸治疗OC的核心成分。

2.4 GO分子功能富集结果

clusterProfiler包对上述120个潜在靶点基因的GO分子功能富集结果表明，桂枝茯苓丸治疗OC中所调节的分子功能主要涉及细胞信号转导、转录和抗氧化等方面，详见图3。

2.5 KEGG通路富集结果

使用clusterProfiler包对上述120个潜在靶点基因的KEGG通路富集分析表明，在P值排名前50条通路中，与OC相关的通路有丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB or PI3K/Akt）信号通路，人乳头瘤病毒感染，白介素17(interleukin-17，IL-17）信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF）信号通路、细胞凋亡、内分泌耐药、辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17）细胞分化，低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路，叉形头转录因子O(forkhead box O，FoxO）信号通路，癌症中细胞程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1，PD-L1）表达和细胞程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1）检查点途径，T细胞受体信号通路，表皮因子生长受体(epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药、Toll样受体信号通路，p53信号通路，铂类药物耐药、ErbB信号通路。详见图4。

表1 桂枝茯苓丸活性成分的具体信息Table 1 Concrete information about active ingredients of Guizhi Fuling Pill

图1 桂枝茯苓丸治疗OC靶点的筛选Figure 1 Screening of targets for OC treated by Guizhi Fuling Pill

图2 桂枝茯苓丸治疗OC的中药-活性成分-靶点网络Figure 2 Herb-active ingredient-target network of Guizhi Fuling Pill for OC

图3 GO分子功能富集Figure 3 Enrichment of GO molecular function

表2 桂枝茯苓丸治疗OC的潜在靶点Table 2 Information about potential targets for OC of Guizhi Fuling Pill

2.6 构建PPI网络

使用STRING网站和Cytoscape软件对桂枝茯苓丸中治疗OC的120个靶点构建PPI网络图，CytoNCA插件分析显示degree值排名前3的靶点依次为：蛋白激酶B(protein kinase B，PKB or AKT1），白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA），这些可认为是桂枝茯苓丸治疗OC的靶点互作网络中的核心靶点，详见图5。

2.7 分子对接

分子对接结果显示，槲皮素、山奈酚、黄芩素等3个核心成分与AKT1、IL-6、VEGFA等3个核心靶点对接的Vina分值≤-9.0有3对，均来自核心成分与AKT1的对接，表明AKT1很可能是桂枝茯苓丸治疗OC的潜在靶点，具体对接结果见图6，其中AKT1蛋白与黄芩素相互作用的Vina分值(即结合能）最佳，为-9.80kcal/mol。结合图7可以看出，黄芩素与AKT1蛋白之间通过5个氢键、4个π-烷基疏水键和5个π-π键成较稳定结构。

3 讨论

本研究利用网络药理学方法和分子对接技术对桂枝茯苓丸治疗OC的潜在治疗机制进行了探索，构建中药-活性成分-靶标网络，该网络表明了桂枝茯苓丸治疗OC具有多成分、多靶点综合作用的特点，该网络的核心化合物为槲皮素、山奈酚和黄芩素。三者属于植物黄酮类化合物，多项研究发现其对于OC细胞具有抑制肿瘤生长及血管生成、干扰细胞周期和诱导细胞凋亡、增强放化疗疗效等作用[8-12]。

图4KEGG通路富集Figure 4 Enrichment of KEGG pathway

图5 桂枝茯苓丸中治疗OC靶点的互作网络Figure 5 Network of interactions among targets for OC in Guizhi Fuling Pill

图6 分子对接结果Figure 6 Results of molecular docking

图7 AKT1蛋白与黄芩素之间相互作用的3D示意图Figure 7 3D diagram of interaction between AKT1 protein and Baicalein

桂枝茯苓丸治疗OC的靶点互作网络直观体现了靶点间的相互作用，该网络的核心靶点为AKT1、IL-6和 VEGFA。AKT1(即 AKT）是 PI3K/AKT通路的重要靶标，磷酸化激活的AKT1通过其激酶活性作用于多个下游靶标，如mTOR、FoxO等，发挥调控细胞的增殖和凋亡、细胞周期、细胞代谢、蛋白质转录以及血管生成等作用，异常活化的AKT可逃避细胞凋亡，促使细胞存活，与肿瘤发生相关[13，14]。研究表明，外源性AKT1促进OC细胞迁移和侵袭，靶向抑制AKT1的表达，可抑制OC细胞生长和侵袭[15，16]。此外，AKT1还与OC化疗耐药的发生有关[17]。IL-6是一种多效炎性因子，是细胞因子级联反应中的核心介质，参与调节炎症与免疫反应，此外，IL-6还与破骨细胞形成有关。IL-6介导的IL-6/STAT3信号通路在OC发生和发展过程中起着重要作用[18]。OC组织分泌IL-6影响PI3K/AKT、Ras/MAPK和JAK/STAT等通路，可促使肿瘤细胞增殖、逃避凋亡和血管生成，还可诱导化疗耐药[19，20]。VEGFA是血管内皮生长因子家族成员，在卵巢癌组织中存在高表达，通过作用于血管内皮细胞，介导血管的通透性，诱导肿瘤血管生成，并可促进细胞增殖、转移及侵袭，抑制细胞凋亡及促进上皮-间充质转化[21，22]。分子对接表明桂枝茯苓丸的核心成分与上述核心靶点之间有较好的结合作用，其中AK1与黄芩素、槲皮素、山奈酚的相互作用较佳，提示AK1很可能是桂枝茯苓丸核心成分干预的靶点。

本研究还识别了桂枝茯苓丸治疗OC的靶点所干预的分子功能及疾病通路，分子功能调节主要集中为细胞信号转导、转录、抗氧化等方面。通路富集结果中与OC治疗相关的潜在通路可进一步归纳为以下几方面：①细胞增殖：ErbB信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路；②细胞凋亡：p53信号通路、TNF信号通路、FoxO信号通路；③血管生成：HIF-1信号通路；④肿瘤免疫：IL-17信号通路、Th17细胞分化、Th1和Th2细胞分化、T细胞受体信号通路、癌症中PD-L1表达和PD-1检查点途径、Toll样受体信号通路；⑤耐药性：铂类药物耐药、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药和内分泌耐药；⑥人乳头瘤病毒感染。

本研究从分子水平揭示了桂枝茯苓丸治疗OC是多成分、多靶点、多通路综合的作用模式，结合核心靶点功能与通路富集结果，推测桂枝茯苓丸治疗OC的机制很可能涉及细胞增殖、细胞凋亡、血管生成、肿瘤免疫、耐药性和人乳头瘤病毒感染等方面，虽然目前尚无相关文献研究报道，但这可为今后进一步阐明桂枝茯苓丸治疗OC的具体机制提供思路，也可为临床应用桂枝茯苓丸治疗OC提供一定参考依据。