3种松乳菇菌种在不同培养基中生长表现

2020-12-05

种子 2020年11期

(贵州大学食用菌研究院，贵阳 550025)

松乳菇(Laclariusdeliciosus)为担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、红菇科、乳菇属，易与松树等形成外生菌根的食用菌[1]，具有药用食用的双重价值。靓丽乳菇是松乳菇家族中子实体颜色为橙黄色的一类，属担子菌门，红菇目，红菇科，乳菇属的一种大型真菌，贵州又称松菌、松毛菌[2]。红汁乳菇呈紫铜色，无辛辣味，口感比橙黄色松乳菇细腻[3]。多汁乳菇子实体呈较暗的红褐色，菌柄折断后会流出较多汁液，俗称奶浆菌。

松乳菇常生长在栎树和马尾松成片的混交林地，且以马尾松较小、栎树较细、松针叶和栎树叶为主的腐殖质表层林地里发生较多。由于菌丝脱离共生树种的根系不能形成子实体，目前还难以实现人工栽培[4]。本试验对3种松乳菇菌种设置相同的母种、原种和液体种培养基，分别接种靓丽乳菇、多汁乳菇和红汁乳菇菌种，研究3种松乳菇菌丝体生长情况，以掌握3种松乳菇生物学特性，为人工驯化栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

靓丽乳菇、多汁乳菇和红汁乳菇3个松乳菇菌株由镇远县黔康源生态农业发展有限公司和贵州大学分别从镇远县羊场镇和贵阳市花溪区黔陶乡收集，在贵州大学农学院园艺实验室纯化培养并供试验。

试管母种培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，磷酸二氢钾0.5 g，牛肉膏2 g，水1 000 mL,pH值7。

原种固体培养基：松木屑35%、麦粒35%、玉米芯10%、麦麸18%、石膏1%、过磷酸钙0.5%、糖0.5%，尿素0.5%，硫酸镁 0.1%，培养基含水量60%～65%,pH值7。

液体种培养基：马铃薯100 g，红糖15 g，葡萄糖10 g，麦麸20 g，蛋白胨20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，维生素B10.5 g，pH值7。

1.2 试验方法

1.2.1菌种的分离(孢子分离法)

1) 种菇的选择

挑选靓丽乳菇、多汁乳菇和红汁乳菇3种松乳菇菇盖肥厚，菇形圆整，菇柄粗壮的单生子实体作为种菇。种菇的菌膜将开而未开，达8～9成成熟度。

2) 孢子收集器准备

在超净工作台内将瓷盆衬4～6层纱布，上面放一只中号的培养皿，皿内放一个不锈钢三角架(供插种菇之用)，再在瓷盆上加盖一只玻璃大漏斗，将孔塞上棉塞，对超净工作台杀菌消毒。

表1 不同松乳菇菌株母种菌丝的生长情况比较

3) 孢子的采取及试管母种培养

在超净工作台内，用镊子分别将3种松乳菇种菇浸入0.1%～0.2%的升汞水溶液中浸泡1 min，取出用无菌水冲洗1～2次，再用灭菌的纱布吸干菇体表面的渍水，轻轻掀开玻璃漏斗，用消毒过的镊子夹种菇迅速插入三角架上，马上盖好，用纱布将漏斗周围塞好，并在纱布上倒0.1%的升汞水。然后将孢子收集皿放入恒温室中培养，使其孢子落下。恒温室温度控制在18～20 ℃之间。当培养皿内有1层淡咖啡色的粉末时即是孢子，应立即进行接种，将斜面培养基及所需用具用0.1% KMnO4抹洗表面，并将灭菌过的注射器一同放入超净工作台内消毒，按无菌操作接种后，随即放于23～28 ℃恒温箱中培养，经9～12 d培养基表面可看到白色星芒状的菌丝丛。

孢子萌发菌丝后，取先端菌丝及时转入普通PDA培养基进行培养，菌丝生长稳定后，转入本试验试管斜面母种培养基培养，每个品种接种10支试管， 3次重复。观察测定菌丝长势、满管时间、菌丝生长速度。满管后的菌种，放入4 ℃左右的冰箱保藏备用。

1.2.2液体种培养基接种、培养

先按本试验液体种培养基配方称量麦麸浸泡30 min，然后将去皮土豆切片与麸皮混合后煮熟30 min，过滤取滤液。将精确称量的磷酸二氢钾、硫酸镁等辅料与土豆、麦麸的滤液充分搅拌均匀，然后把制作好的液体菌种培养基静置一段时间，待其中的固体物质沉淀后取上清液装入三角瓶，装入500 mL三角瓶内，每瓶装量为100 mL，加入15粒左右的小玻璃珠，用棉塞封口后置1.5 kg压力下灭菌30 min，取出待温度为30 ℃时接种。每瓶接入1.5～2 cm2的斜面菌种一块，让其悬浮于液体培养基表面且使菌丝朝上，在适温下静置培养48 h。接种完后塞紧塞子，贴上标签。每个品种接种5瓶， 3次重复。当菌丝长至液体培养基中时，置摇床上进行振荡培养。往复式摇床振荡频率为80～100次·min-1，振幅6～10 cm。将接种好的三角瓶放到25～28 ℃的环境中进行避光静止培养72 h后，将已经萌发并且没有杂菌污染的三角瓶放到回旋式摇床上进行培养，让3种松乳菇培养瓶保持相同转速匀速转动，摇床摇速控制在160～200次·min-1之间,控制液体菌种培养液的培养温度在24～26 ℃之间。

1.2.3原种培养基装袋、灭菌，接种培养

按原种培养基配方比例称取培养料主料、辅料，充分拌匀，调节含水量至60%，装入12 cm×24 cm的聚丙烯塑料袋,每袋装干料300 g，机械免锅炉灭菌锅LGB-1500*4500灭菌2 h，冷却到30 ℃以下接种3种松乳菇菌种。每个处理接种5袋，3次重复。接种完将菌包放入人工气候箱，保持温度25 ℃，相对湿度65%～70%，避光培养。

1.3 测定项目

1.3.1固体菌种培养基菌丝体生长数据测量

3种松乳菇接种到培养基5 d后，根据菌落边缘，将起始线画在试管或菌袋上。之后以3 d为一个阶段，对菌丝生长潜力(颜色，密度，生长潜力，菌落边缘均匀性)进行观察并记录。观察到母种菌丝充满试管，原种菌丝充满整个菌袋后，用记号笔画终止线。测量菌丝体的平均长度和满(管)袋天数。

菌丝体生长数据测量:从菌丝的中心到生长的最远端测得的半径长度作为菌丝生长的长度再除以菌丝满管或者满袋的时间得出菌丝日均生长速度。

菌丝体生长速率(mm·d-1)=菌丝体长度(mm)/菌丝生长期(d)。

菌丝干重测量：将培养10 d的松乳菇试管母种加热，使其中的琼脂完全溶解，再将其放入90～100 ℃热水中漂洗2次，放入烘箱内烘干后，采用电子天平称重。

1.3.2液体培养基中的菌球个数、菌丝生长速率

液体菌种培养7 d后，菌球基本布满培养瓶，各品种松乳菇培养瓶依次用注射器抽取30 mL液体培养液，抽出后注射到培养皿上静置，计数菌球个数并记录。

1.4 数据分析

采用Excel 2010软件和SPSS 25.0软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同松乳菇菌株原种菌丝生长情况

从表1可知，在相同母种培养基中，靓丽乳菇生长速度最快，日均生长量为1.13 mm，红汁乳菇菌丝的生长速度相对较慢，靓丽乳菇与红汁乳菇菌丝的生长速度达显著差异；多汁乳菇菌丝的生长速度与靓丽乳菇和红汁乳菇无显著差异。

靓丽乳菇和多汁乳菇长势一致，均为菌丝浓密、粗壮，菌落边缘整齐，靓丽乳菇菌丝萌发期白色，满管白色间黄色，多汁乳菇萌发期白色，满管白色间红褐色；红汁乳菇菌丝长势稍弱，萌发期白色，满管白色间红绿色。

3种松乳菇菌丝干重以靓丽乳菇(0.295 g)与多汁乳菇(0.273 g)值较大，红汁乳菇菌丝干重值较小(0.186 g)。靓丽乳菇、多汁乳菇与红汁乳菇菌丝干重差异达显著水平。

2.2 液体培养基中松乳菇菌丝的生长情况

从表2可以看出，在摇床培养相同时间的每30 mL液体培养基中，靓丽乳菇在液体培养基中的菌球数量最多，平均达54.7个·(30 mL)-1，红汁乳菇次之，靓丽乳菇与红汁乳菇在液体培养基中的菌球数差异不显著，多汁乳菇在液体培养基中的菌球最少，平均41个·(30 mL)-1，并与靓丽乳菇和红汁乳菇在液体培养基中的菌球数达显著差异。

表2 不同松乳菇菌株在液体培养基中菌丝生长速率

2.3 不同松乳菇菌株原种菌丝生长情况分析

由表3可知，在相同原种培养基中，3种松乳菇的菌丝生长速度由快到慢依次为：靓丽乳菇(0.385 mm·d-1)、多汁乳菇(0.356 mm·d-1)、红汁乳菇(0.293 mm·d-1)。靓丽乳菇和多汁乳菇在原种培养基上菌丝长势强，二者菌丝生长速度无显著差异；红汁乳菇菌丝生长速度较慢，且与靓丽乳菇和多汁乳菇差异显著。

3种松乳菇菌丝满袋时间为靓丽乳菇(35 d)<多汁乳菇(37 d)<红汁乳菇(40 d)。

3种松乳菇在原种培养基中菌丝颜色，靓丽乳菇为白间黄，红汁乳菇为白色间暗红色，多汁乳菇为白间褐黄。