酵母、乳酸菌作为发酵剂对天麻总酚含量及还原能力的影响

蔡倪 许译文 张东亚 李静雯 许曌昕 郭启鹏 曾荣妹

摘 要：本文以酿酒酵母、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌为发酵剂对天麻进行发酵，研究发酵和浸提作用对天麻素、对羟基苯甲醇、总酚含量和还原力的影响，以期对天麻酒、酵素的开发提供参考。结果表明，酒精发酵和乳酸发酵过程能有效促进对羟基苯甲醇转化为天麻素，发酵剂对天麻素和对羟基苯甲醇总含量有不同影响;添加发酵剂与对照组比较，总酚含量均降低，酿酒酵母对总酚含量降低的影响更大;酵母和乳酸菌参与发酵会影响天麻的还原能力，在0.1～0.4 mL的体积范围内，只有酿酒酵母作用的天麻发酵液还原能力最强。

关键词：天麻;酵母;乳酸菌;发酵;酚类

Abstract：In this paper， Saccharomyces cerevisiae， lactic acid bacteria bulgaricus and Streptococcus thermophilus were used as fermentation agents to ferment Gastrodia elata Blume. The effects of fermentation and extraction on the contents of gastrodin， 4-Hydroxybenzyl alcohol， total phenol and reducing power were studied in order to provide reference for the development of Gastrodia elata wine and fermented beverage. The results showed that Ethanol Fermentation and lactic acid fermentation could effectively promote the conversion of 4-Hydroxybenzyl alcohol to gastrodin， and the fermentation agents had different effects on the total contents of gastrodin and 4-Hydroxybenzyl alcohol; compared with the control group， the content of total phenols was decreased， and Saccharomyces cerevisiae had more influence on total phenol content; the participation of yeast and lactic acid bacteria in the fermentation could affect the reducing ability of Gastrodia elata Blume. In the volume range of 0.1～0.4 mL， Saccharomyces cerevisiae had the strongest effect on the reducing force of Gastrodia elata fermentation.

Key words：Gastrodia elata Blume; Yeast; Lactic acid bacteria; Fermentation; Phenols

中圖分类号：R284

天麻（Gastrodia elata Blume）中的酚类成分是已知化学成分中占比最高的成分类群，包括酚类、酚苷类、酚醚类、酚醛类和含硫酚类[1]。天麻素（Gastrodin，GAS）、对羟基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HBA）等主要酚类成分具有抗抑郁、改善记忆、镇静催眠等作用[2-4]，天麻的总酚含量还与其抗氧化能力密切相关[5]。国卫食品函〔2019〕311号中提出对天麻开展按照传统既是食品又是中药材的物质生产经营试点工作，在食药兼用、保健功能的开发方面，天麻发酵型保健酒[6-9]的研究较多。发酵能将原料中大部分活性成分保留，还能增加微生物代谢合成的有益物质，有利于人体健康。酵素同样是一种具有保健功能的发酵产品。近年来，具有药食两用植物保健功能的酵素产品开发成为新的研究趋势[10]。

酵母菌和乳酸菌是酿酒和酵素生产中重要的两类发酵微生物[11-13]。在发酵过程中，酵母菌主要进行酒精发酵，并合成多种风味物质;而乳酸菌主要进行乳酸发酵，能产生氨基酸和各种维生素，提高酚类物质生物利用率[14]。目前有关浸提和酵母、乳酸菌发酵对天麻的活性成分的影响报道较少，本文以天麻素、对羟基苯甲醇、总酚和还原力为考察指标，探究酿酒酵母和保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌对天麻浸提发酵液中几种指标的影响，为天麻酒、酵素的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

贵州大方乌天麻、白砂糖：市售优质品;高活性果酒干酵母、乳酸菌粉（保加利：亚乳杆菌、嗜热链球菌）：安琪酵母股份有限公司。

三氯化铁、抗坏血酸，国药集团化学试剂有限公司;没食子酸，天津市科密欧化学试剂有限公司;无水碳酸钠，天津市永大化学试剂有限公司;铁氰化钾（≥99.5%）、三氯乙酸，上海麦克林生化科技有限公司;磷酸：天津市富宇精细化工有限公司;以上试剂均为分析纯。天麻素（≥98%），Sigma-Aldrich公司;羟基苯甲醇（111970-201702，≥99.4%），中国食品药品检定研究院;PBS磷酸盐缓冲液、1N福林酚

（BR级），Solarbio公司;乙腈（LC级），美国Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要仪器和设备

安捷伦1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）、TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、GTR16-2高速冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司）、FA2004型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、DXF-02C100粉碎机（广州市大祥电子机械设备有限公司）、SPX-150C恒温恒湿培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、HH-6型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）、0.22 μm针头过滤器（天津领航实验设备股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

将乌天麻块茎用粉碎机粉碎，过60目筛得天麻粉。称取一定量的天麻粉和白砂糖，分成等重的4份，每份与30倍的水混合搅拌均匀。灭菌，快速冷却至室温，置于超净工作台紫外照射30 min。其中3份分别加入等量的酵母、乳酸菌、酵母和乳酸菌（比例为1∶1），混匀。4份样品置于40 ℃培养箱若干小时，取出过滤，滤液灭菌冷却后测定指标。未加发酵剂的样品D为对照组，见表1。

1.2.2 天麻素和对羟基苯甲醇含量的测定

参考2015版《中华人民共和国药典》中的RP-HPLC

法测定天麻素和对羟基苯甲醇的含量[15]。

（1）对照品溶液的配制。精密称定天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品，加乙腈-水（3∶97）混合溶液制成每1 mL含天麻素50 μg、对羟基苯甲醇25 μg的混合溶液。

（2）样品和对照品的测定。色谱条件：检测波长220 nm，进样量10 μL，流速1 mL·min-1，柱温25 ℃，

色谱柱： Hypersil BDS C18色谱柱（250×4.6 mm，

5 μm，130A），流动相乙腈-0.05%磷酸（体积比

为3∶97）。

取适量样品10 000 r·min-1离心5 min，过0.22 μm滤膜待上机测定。用进样器分别吸取10 μL样品、天麻素标准溶液、对羟基苯甲醇标准溶液，在上述色谱条件下，用高效液相色谱仪测样品及对照品的吸收峰。

1.2.3 总酚含量的测定

（1）标准曲线绘制。采用福林-酚法测定[16]。以没食子酸浓度x（mg·mL-1）对吸光度y回归，得到标准曲线方程y=3.453 6x+0.008 8，R2=0.995 9，如图1所示。

（2）样品测定。分别精确量取0.10 mL待测样品于10 mL试管中，加入1.0 mL福林-酚试剂，1 min后加入15%碳酸钠溶液1.5 mL，然后加水使总体积为4.5 mL，混匀，75 ℃水浴避光反应10 min，冷却，在760 nm处测定吸光度，平行测定3次，取平均值，以蒸馏水为参比溶液。样品的总酚含量以没食子酸浓度为等价物表示。

1.2.4 还原力的测定

分别精确量取0.10、0.20、0.30、0.40 mL和0.50 mL

样品于编号不同的试管中，加水至3.0 mL，加入1.0 mL磷酸鹽缓冲溶液（pH 6.6，0.2 mol·L-1），再加入1%的铁氰化钾1 mL，混合物置于50 ℃恒温水浴反应20 min，

然后加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL，混合均匀后取上清液1 mL，加入0.1%三氯化铁0.2 mL室温下反应。10 min后在700 nm处测定其吸光度，以蒸馏水为参比溶液，以0.1 mg·mL-1的维生素C标准溶液做对照。

2 结果与分析

2.1 样品的天麻素和对羟基苯甲醇含量

混合标样和4种样品的天麻素、对羟基苯甲醇HPLC图谱如图2、图3所示。

根据峰面积计算出4种样品的天麻素、对羟基苯甲醇的含量见表2。结果表明，与未添加发酵剂相比，酵母和乳酸菌参与发酵能提高天麻素占比，酒精发酵和乳酸发酵过程能有效将对羟基苯甲醇转化为天麻素，酿酒酵母的转化作用更加明显;有酵母参与发酵的天麻浸提液中天麻素和对羟基苯甲醇的总含量明显降低，只存在酵母作用的样品A总含量减少了1.895 mg/100 g，这可能是因为酵母的生长繁殖会消耗部分天麻素和对羟基苯甲醇;只存在乳酸菌作用的样品B总含量增加了0.637 mg/100 mg，说明乳酸发酵过程可提高天麻素和对羟基苯甲醇的浸出。

2.2 天麻样品的总酚含量

由图4可知，不同发酵剂对天麻浸提液的影响较大。与未添加发酵剂相比，当发酵和浸提同时进行时，酵母和乳酸菌的发酵作用会降低天麻浸提液中的总酚含量。总酚含量样品D>样品B>样品C>样品A，未添加发酵剂的样品总酚含量最高，达0.210 mg·mL-1，受酵母的酒精发酵过程影响，样品A的总酚含量最低，含量为0.154 mg·mL -1，结果与发酵苹果酒的总酚变化规律相似[17]。这可能与发酵液中溶氧导致多酚氧化含量降低和微生物发酵速率有关;另外，酵母具有促进酚类转化的作用[18]，并且设定的发酵温度更加有利于乳酸菌的生长繁殖。

2.3 样品的还原力

4种样品的吸光度与0.1 mg·mL-1的维生素C吸光度对比见表3，吸光度越大，表明还原力越强。结果表明，4种样品均有一定的还原力。用量为0.1 mL时，4种样品和浓度为0.1 mg·mL-1的维生素C溶液的吸光度相差较小，还原能力接近。随着体积用量的增多，吸光度增大，还原力增加，样品A、B、C和维生素C的增势变缓。在用量≤0.4 mL时，只有酵母作用的样品A还原能力最强，吸光度为0.536;而体积达0.5 mL时，样品D的还原能力最强，吸光度为0.630。乳酸菌作用的样品B还原力在4种样品中最弱。说明天麻浸提液中具有还原性的物质不只是天麻素和对羟基苯甲醇，乳酸菌的生长繁殖可能会消耗部分还原性物质。还原力样品A>样品C>样品B，酵母和乳酸菌参与发酵并不一定增强天麻浸提液的还原力。

3 结论

酒精发酵和乳酸发酵过程能有效促进对羟基苯甲醇转化为天麻素。酿酒酵母参与发酵会降低天麻素和对羟基苯甲醇的总含量，而保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的生长繁殖使天麻发酵液呈酸性（pH≤3.65），能增加天麻素和对羟基苯甲醇的总浸出量。

实验中添加酵母、乳酸菌发酵剂的天麻发酵液与对照组相比，总酚含量均降低。酿酒酵母比保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌对总酚含量降低的影响更大。

酵母和乳酸菌参与发酵会影响天麻的还原能力。当体积为0.1 mL时，实验中4种天麻样品的还原力差异较小，并且与0.1 mg·mL-1维生素C标准溶液还原力相当。随着体积的增加，还原力均呈现增大的趋势。

在0.1～0.4 mL的体积范围内，只有酿酒酵母作用的天麻发酵液还原能力最强。

参考文献：

[1]张成宸，石京山.天麻的酚类成分及其中枢神经药理作用研究进展[J].中药药理与临床，2019，35（2）：167-174.

[2]张志龙，郜玉钢，臧埔，等.天麻素、对羟基苯甲醇对中枢神经系统作用机制研究进展[J].中国中药杂志，2020，45（2）：312-320.

[3]Sun W，Miao B，Wang X C，et al.Gastrodin inhibits

allodynia and hyperalgesia in painful diabetic neuropathy

rats by decreasing excitability of nociceptive primary sensory neurons[J].Plos One，2012，7（6）：e39647.

[4]Farooq U，Pan YJun，Lin Yanfei，et al. Structure Characterization and Action Mechanism of an Antiaging New Compound from Gastrodia elata Blume[J].Oxidative medicine and cellular longevity，2019，2019：1-10.

[5] 孫海燕.天麻多酚的超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].食品与机械，2016，32（10）：158-163.

[6]王准生，伍佳琪.天麻、刺梨、蜂蜜复合发酵酒的研制[J].中国酿造，2006（1）：76-78.

[7]高远，谢春阳，刘博.天麻发酵酒的研制[J].农产品加工（学刊），2012（1）：80-82，85.

[8]李刚凤，刘健，杨娟，等.天麻米酒发酵工艺优化[J].食品研究与开发，2019，40（19）：118-122.

[9]于倩，张艺，苏瑶，等.天麻提取酒液与天麻渣液态发酵酒的调配酒初探[J].食品科技，2020，45（3）：100-104.

[10]饶智，陈彦坤，刘斌，等.“药食同源”植物酵素研究进展[J].食品与发酵工业，2020，46（9）：290-294.

[11]梁红敏，刘洁，史红梅.食用植物酵素研究进展[J].食品工业，2020，41（7）：193-197.

[12]刘加友，王振斌.微生物酵素食品研究进展[J].食品与发酵工业，2016，42（1）：273-276.

[13]赵欠，王巧碧，周才琼.酿酒酵母相关营养功能成分的研究及应用进展[J].中国酿造，2015，34（6）：15-18.

[14]顾翰琦，刘冉，邵玲智，等.酿酒酵母对酚类抑制物耐受性研究[J].生物技术通报，2020，36（6）：136-142.

[15]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[16]朱宝镛.葡萄酒工业手册[M].北京：中国轻工业出版社，1995.

[17]李国薇，樊明涛，王胜利，等.酵母菌种对苹果酒主发酵过程中的多酚组成及抗氧化活性的影响[J].中国酿造，2012，31（10）：33-37.

[18]康燕山，黄薇，袁唯，等.普洱茶发酵过程中添加外源酶及外源酵母对主要成分的影响[J].云南农业大学学报（自然科学），2015，30（5）：784-789.