基于太赫兹时域光谱技术的黄酮类化合物研究

殷 明，王建林，黄浩亮，黄秋萍，杨萌萌，傅正平，陆亚林*

1. 中国科学技术大学国家同步辐射实验室，安徽 合肥 230026 2. 中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家研究中心，安徽 合肥 230026 3. 中国科学技术大学化学与材料科学学院，安徽 合肥 230026

引 言

黄酮类化合物泛指两个苯环通过中央三碳链连接而成的一类化合物，常以游离或糖苷形式广泛存在于植物体内的一大类多酚物质，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抑制肿瘤生长等药理作用。 目前中草药市场上以次充好、以假乱真的现象比较常见，严重扰乱市场秩序和消费者身体健康，为了确保药品质量安全和保护消费者权益，采用一种可靠、有效的中草药检测方法是必不可少的。 传统的中草药检测方法包括光谱法[1]、色谱法[2-3]、质谱法[4-5]等，但是每种方法各有优劣，没有一种方法可以解决所有问题。

太赫兹(Terahertz, THz)波是指频率在0.1～10 THz范围内的电磁波，该频段内包含了大量有关物质的物理、化学和结构信息以及多种分子振动模式，很多生物分子在太赫兹波段都有明显的特征吸收峰，太赫兹谱学在食品、药品、生物医学领域有重要的应用价值[6]。 本文利用太赫兹时域光谱技术(THz-TDS)研究常见的黄酮类化合物在太赫兹波段的光谱特性，同时利用几种化学计量学方法对不同种类的黄酮类物质进行种类鉴别和定量分析，为中草药的检测提供一种无损、快速、有效的分析方法，在中药材市场检测中具有重要的应用价值。

1 实验部分

1.1 设备

本文实验装置使用自搭的透射式THz-TDS系统，其原理图如图1所示。 通过测量得到太赫兹脉冲透过样品和参考信号的振幅和相位信息，利用样品信号[Es(ν)]和参考信号[Er(ν)]计算得到透射系数[T(ν)]，透射系数定义如式(1)

(1)

式(1)中，ν是频率，d为样品厚度，c为真空中的光速，a表示吸收系数，n表示折射率，根据式(1)中的实部和虚部，可以计算出样品的折射率(n)和吸收系数(a)如式(2)和式(3)所示

(2)

(3)

图1 透射式太赫兹时域光谱系统原理图Fig.1 Schematic diagram of transmission terahertztime-domain spectroscopy system

其中，w是角频率，φ(ω)为相位差，ρ(ω)为幅值比，k(ω)表示消光系数。

1.2 样品制备

研究了8种常见的黄酮类化合物，它们包括黄芩素、槲皮素、柚皮素、大豆素、黄芩苷、葛根素、染料木素和天麻素。 所有样品纯度均大于99%，并购买于同一批次，实验前均放在恒温恒湿箱中保存，未经过其他预处理。 实验样品制备采用粉末压片法，首先将样品在玛瑙研钵中充分研磨，然后与高密度聚乙烯粉末(HDPE)按照1∶2比例进行充分混合，最后在压片机下制成厚度为1 mm的薄片。 在做分类鉴别研究时，每种黄酮类物质制备10个样品，一共80个样品作为待测样品； 在做定量预测分析时，将黄酮类物质与淀粉混合配制不同浓度的待测样品，浓度范围从10%～90%(w/w)(间隔10%)，每种浓度制备10个样品，共90个样品作为待测样品。 在建立定性和定量模型时将每种黄酮类物质按照比例随机分成校正集(70%)和预测集(30%)。

2 结果与讨论

2.1 光谱分析

实验在室温下利用THz-TDS测量了所有黄酮类化合物样品，为了保证实验数据准确性，每个样品测量3次取平均值得到样品的太赫兹时域信号，原始时域信号经过Savitsky-Golay滤波预处理后，再通过计算得到样品在0.2～2.5 THz范围内的吸收系数，8种黄酮类物质的THz吸收谱如图2所示。 从图中可以看出，虽然这些黄酮类物质具有相似的分子结构，但每种物质在太赫兹波段都有明显不同的特征吸收峰，体现了太赫兹对生物分子的指纹谱特性。 因此，可以通过太赫兹吸收谱对黄酮类物质进行种类鉴别。

图2 8种黄酮类物质的太赫兹吸收谱Fig.2 Terahertz absorption spectra of eight flavonoids

2.2 低温分析

实验测试了柚皮素和大豆素在78～320 K温度范围内的的太赫兹吸收光谱，结果如图3所示，从图中可以看出，随着温度的降低，柚皮素和大豆素的三个吸收峰逐渐增强，并且吸收峰频率位置发生轻微的蓝移，柚皮素的三个吸收峰1.4，1.58和1.78 THz分别蓝移到1.42，1.6和1.80 THz，平移量为0.02 THz。 大豆素的三个吸收峰0.97，1.24和1.75 THz分别蓝移到0.98，1.25和1.76 THz，平移量为0.01 THz。 通常，随着温度的降低，吸收峰变得更尖锐主要是能量振动态分布随温度变化的结果，而由温度引起的吸收峰位置的频移被认为是多种机制作用的结果，其中，蓝移主要是由于热膨胀引起的键长增加以及振动势的非谐性导致的，红移主要是由于分子间弱相互作用力导致的[7-10]。

图3 柚皮素和大豆素随温度变化的吸收谱Fig.3 Temperature dependent of absorption spectra of naringenin and daidzein

2.3 定性鉴别

主成分分析(principal component analysis, PCA)是一种基于统计学的无监督模式识别方法，可以用来提取特征变量、降低数据维度以及可视化数据结构。 支持向量机(support vector machines, SVM)是一种机器学习算法，具有很强的学习能力和泛化性能，可以有效地解决非线性的分类问题。 本文首先通过PCA方法对原始光谱数据提取特征变量，图4所示为所有样品吸收谱做主成分分析得到的三维得分图，其中，前五个主成分的累计方差贡献率超过了98%，代表了原始数据的主要信息。 因此，可以提取前五个主成分作为SVM分类模型的输入变量。 利用SVM在校正集上建立分类模型，选择RBF径向基核函数优化模型，利用网格搜索寻找最优参数，得到正则化参数c=0.735 6和核参数g=1.435 3，交叉验证CV达到100%最高值，最后利用训练好的分类模型在预测集上对8种黄酮类物质做分类鉴别，最终得到分类准确率达到100%。 对比原始光谱数据作为支持向量机的输入变量，本文利用PCA提取前五个主成分分量作为SVM输入变量来建立校正模型，不仅提取了特征变量，而且减少了运算量，提高了运行效率和模型精确度。

图4 8种黄酮类物质太赫兹吸收谱的PCA三维得分图Fig.4 PCA three-dimensional score map for terahertzabsorption spectra of eight flavonoids

2.4 定量分析

利用偏最小二乘回归(partial least squares regression, PLSR)和人工神经网络(artificial neural network, ANN)回归模型对淀粉中不同含量的黄酮类物质进行定量分析，其中ANN模型采用RBF神经网络。 在做定量预测分析过程中，通常用相关系数R2和均方根误差RMSE两个指标来衡量模型的性能，其中，R2和RMSE的表达式如式(4)和式(5)所示

(4)

(5)

实验测量得到了淀粉中不同浓度柚皮素和大豆素的太赫兹时域光谱如图5(a)和(c)所示。 从图中可以看出，随着淀粉中黄酮类物质浓度含量的增加，吸收峰强度也随着增强。 利用两种回归方法对淀粉中黄酮类物质的浓度建立了定量预测模型，其预测结果如图5(b)和(d)所示，图中显示了淀粉中黄酮类物质的真实浓度和预测浓度之间的关系。 对淀粉中不同浓度含量的柚皮素的定量分析中，利用PLSR回归模型得到的预测结果为： 有效成分含量预测值与其真实值之间的相关系数R2=0.991 1，均方根误差RMSE=2.428 8。 利用ANN回归模型得到的预测结果为：R2=0.994 4，RMSE=1.932 5。 对淀粉中不同浓度含量的大豆素的定量分析中，利用PLSR回归模型得到的预测结果为：R2=0.992 8，RMSE=2.188 5。 利用ANN回归模型得到的预测结果为：R2=0.996 4，RMSE=1.544 1。 对比两种模型预测结果可以看出，ANN模型具有更高的相关系数以及更低的均方根误差，因此，结果证明了利用THz-TDS对淀粉中不同浓度含量的黄酮类化合物做定量分析时，ANN模型具有较高的预测精度。

3 结 论

利用THz-TDS研究了8种常见的黄酮类化合物在0.2～2.5 THz波段的生物分子特性，结果显示均具有明显不同的特征吸收峰，并研究了它们在78～320 K温度范围内随温度变化的吸收特性，结果表明，随着温度的降低，特征吸收峰逐渐增强，主要是由能量振动态分布的影响，并且吸收峰位置发生蓝移，主要是由于热效应以及振动势的非谐性导致的。 另外，通过化学计量学方法对这些黄酮类化合物进行种类鉴别和定量分析，首先利用PCA提取光谱特征变量，然后将前五个主成分分量作为SVM的输入变量进行分类鉴别，通过优化模型得到最优参数，得到分类准确度为100%。 另外，采用PLSR和ANN回归模型对淀粉中含有不同浓度的黄酮类物质做定量检测，结果ANN方法得到了最高的预测精度。 综上所述，本文利用THz-TDS技术研究了黄酮类物质在太赫兹波段的生物分子特性，并结合化学计量学方法为黄酮类物质提供了一种快速、有效、无损的分类鉴别和定量分析方法，对中草药的检测和质量监控领域具有实际的应用价值。