紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TS的建立及多药耐药性比较

尹茳平,王 琪,张 玮,黎丹戎,李 力*

0 引言

卵巢癌是我国致死率最高的妇科恶性肿瘤，初始治疗以手术联合化疗为主，其中紫杉醇联合铂类是最常用的一线化疗方案之一[1]。紫杉醇成分复杂，其抗癌活性成分属于四环二萜类化合物，主要通过影响α、β微管蛋白的动态平衡以及二聚体的形成，抑制肿瘤细胞增殖并促其凋亡[2]。在长期治疗中，与其他化疗药物类似，紫杉醇也会出现继发性耐药[3]。深入探讨卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药机制，对于提高紫杉醇的临床应用和疗效具有十分重要的价值。目前基础研究多选择二维培养的耐药细胞模型，包括浓度梯度递增法、间歇诱导法等[4]，但都存在一定的局限性。近年来，三维细胞模型培养备受关注[5]，本文拟通过二维和三维培养系统构建不同的SKOV3紫杉醇耐药细胞株，为建立理想的体外耐药细胞模型提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

1.1.1 实验细胞 人卵巢癌细胞株SKOV3购自中国科学院上海生物细胞研究所。

1.1.2 实验药物 紫杉醇(TAX，规格：30 mg，国药准字H10980068，山东齐鲁制药厂)、奥沙利铂[L-OHP，规格：50 mg，国药准字H20093892，费森尤斯卡比(武汉)医药有限公司]、吉西他滨(GCB，规格：200 mg，国药准字H20030104，江苏豪森药业集团有限公司)、米托蒽醌(MIT，规格：5 mg，国药准字H10960189，四川升和药业股份有限公司)、环磷酰胺(CTX，规格：200 mg，国药准字H32020857，江苏恒瑞医药股份有限公司)。

1.1.3 主要试剂 Ⅰ型鼠尾型胶原和噻唑蓝(MTT)，美国Sigma公司；Ⅰ型胶原酶、RPMI1640培养液、特基胎牛血清和胰蛋白酶，美国Hyclone公司；实时定量PCR试剂盒，大连宝生生物工程有限公司。

1.1.4 主要仪器 超净工作台，山东BIOBASE科学仪器有限公司；CKX41-A32PH型倒置相差显微镜，日本奥林巴斯；酶标仪，美国Molecular公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单层(二维)细胞培养 取冻存SKOV3细胞，室温下复苏后，加入RPMI1640完全培养液，置于无菌条件下的CO2培养箱内培养。次日更换培养液，待细胞融合率超过70%时，用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化，继续传代培养。

1.2.2 浓度梯度递增法建立SKOV3/TS-1耐药细胞株 取对数期生长的SKOV3细胞，置于细胞培养皿中，细胞浓度为2×106个/ml。加入0.02 μg/ml紫杉醇溶液，48 h后更换为正常培养液，继续培养2～3周后，逐级递增紫杉醇干预浓度，待SKOV3细胞可在0.1 μg/ml的含药培养液中稳定生长，即得到SKOV3/TS-1耐药细胞株。

1.2.3 三维细胞培养 采用Liquid Overlay技术，取对数期生长的SKOV3细胞，接种于含有胶原培养液(ddH2O∶PBS∶胎牛血清∶Ⅰ型鼠尾型胶原∶RPMI1640培养液=1∶1∶1∶2∶5，pH值7.0)的培养皿中，细胞浓度为2×106个/ml。置于37 ℃、CO2培养箱内培养1.5 h，待完全凝固成为细胞培养层后，加入RPMI1640培养液作为覆盖层，隔日更换一次新鲜培养液。将得到的细胞命名为SKOV3/TS-2。

1.2.4 细胞形态学观察 利用倒置相差显微镜，观察二维培养及三维培养条件下的SKOV3/TS-1和SKOV3/TS-2细胞形态学变化，拍照记录。

1.2.5 药物敏感性测定 取二维培养的SKOV3细胞和SKOV3/TS-1细胞，调整细胞浓度为1×104个/ml。以100 μl/孔接种于96孔板中，置于37 ℃、CO2培养箱内培养24 h，待贴壁生长后，更换含药培养液，继续培养72 h。另取三维培养的SKOV3/TS-2细胞，以相同方式接种于含有胶原培养液的96孔板中，覆盖层培养液中加入不同药物干预，继续培养72 h。采用MTT法检测细胞增殖抑制率，绘制抑制率曲线，计算半数抑制浓度(IC50)和耐药指数(Resistance index，RI)。药物浓度设定参考临床用量的血药峰浓度，上下浮动55倍，见表1。

表1 交叉耐药的药物浓度设定

RI=IC50(SKOV3/TS)/IC50(SKOV3)

1.2.6 实时荧光定量PCR法检测多药耐药相关基因 收集SKOV3细胞、SKOV3/TS-1或SKOV3/TS-2细胞1×107个，加入TRIzol试剂提取总RNA。采用逆转录试剂盒制备cDNA。逆转录条件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min，最后80 ℃ 5 min。以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR试剂盒进行基因扩增，反应条件：95 ℃ 5 min，90 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40个循环。内参选择β-actin。以2-△△CT法计算目的基因的表达量。β-actin引物：上游引物5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′；下游引物5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′。多药耐药基因1(Multidrug resistance 1，MDR1)引物：上游引物5′-GGA CTG AGC CTG GAG GTG AAG AA-3′；下游引物5′-CGC TCC TTG ACT CTG CCA TTC TG-3′。β-微管蛋白Ⅲ型(β-tubulin-III，TUBB3)引物：上游引物5′-CGC GGA TCC GCA GGA AAT TTA GAA GA-3′；下游引物5′-CCG GAA TTC TTA GGC ATA CCT GGT CAT GTC TCC-3′。谷胱甘肽S转移酶π(Glutathione s-transferase-π，GST-π)引物：上游引物5′-CCA ATA CCA TCC TGC GTC AC-3′；下游引物5′-TCA CTG TTT CCC GTT GCC CAT-3′。

2 结果

2.1 SKOV3细胞、SKOV3/TS-1细胞、SKOV3/TS-2细胞形态学观察 经倒置相差显微镜观察，二维培养的SKOV3细胞和SKOV3/TS-1细胞呈贴壁生长，细胞体积较小，形态均匀一致。与SKOV3细胞相比，SKOV3/TS-1细胞大小、形状不一，且细胞体积偏大，核分裂相增多。而三维培养的SKOV3/TS-2细胞呈圆形，悬浮于胶原培养液中聚团生长，多细胞球大小不一、形状不规则。见图1。

图1 倒置相差显微镜观察SKOV3细胞(A)、SKOV3/TS-1细胞(B)、SKOV3/TS-2细胞(C)形态学特点

2.2 SKOV3细胞、SKOV3/TS-1细胞、SKOV3/TS-2细胞对TAX敏感性检测 经MTT法检测，SKOV3细胞、SKOV3/TS-1细胞、SKOV3/TS-2细胞对TAX药物的IC50为(0.240±0.078)μg/ml、(4.285±0.538)μg/ml、(3.540±0.356)μg/ml，SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞RI分别为17.85和14.75。见图2、表2。

表2 其他化疗药物对SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞增殖抑制的IC50

2.3 SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞对其他化疗药物交叉耐药性检测 经MTT法检测，SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞对CTX、L-OHP、GCB、MIT均有一定的耐药性，且SKOV3/TS-2细胞的耐药性高于SKOV3/TS-1细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 不同化疗药物干预条件下SKOV3细胞、SKOV3/TS-1细胞、SKOV3/TS-2细胞增殖曲线

2.4 SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞多药耐药相关基因表达变化 经实时荧光定量PCR法检测，SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞TUBB3mRNA和MDR1mRNA表达量高于SKOV3细胞，差异有统计学意义(P<0.05)；而3种细胞GST-π mRNA表达基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞多药耐药相关基因表达差异

图2 不同TAX干预条件下SKOV3细胞、SKOV3/TS-1细胞、SKOV3/TS-2细胞增殖曲线

3 讨论

紫杉醇是卵巢癌一线化疗药物之一[6]，但是耐药性问题一直是困扰临床的重要难题。耐药细胞株模型的建立，对于深入阐述肿瘤细胞的耐药机制、逆转多药耐药性以及提高临床化疗效果有重要价值。既往的基础研究中最常采用的耐药细胞株都属于单层贴壁(二维)培养系统，包括高浓度间歇诱导法[7]、药物浓度递增诱导法[8]、高浓度反复间歇诱导与药物浓度递增相结合法[9]等，一方面由于操作步骤繁琐、药物剂量不好把握、培养周期过长等，另一方面不能完全模拟体内肿瘤微环境，因此耐药性有限，在实验过程中存在一定的局限性。

注：*与SKOV3细胞相比，P<0.05；#与SKOV3/TS-1细胞相比，P<0.05

注：*与SKOV3细胞相比，P<0.05

三维细胞培养系统是近年新发展的一项细胞培养技术，利用具有三维结构的支架材料作为载体[10]，例如本研究中所使用的Ⅰ型鼠尾型胶原，此外还包括琼脂糖、Matrigel、壳聚糖、明胶等，与细胞共同培养，通过构建细胞-细胞-载体三维空间结构，既能保留天然细胞微环境的物质结构基础,又能更好地模拟体内细胞生长的微环境[11]，因此，三维培养系统得到的细胞更贴近体内肿瘤微环境，对于耐药机制的研究更具有临床指导价值。

本研究分别通过二维培养系统和浓度梯度递增法建立TAX耐药细胞株SKOV3/TS-1，通过三维培养系统建立SKOV3/TS-1细胞株，通过MTT法验证，两种细胞模型对TAX均具有显著耐药性，RI分别为17.85和14.75。说明SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞对TAX的敏感性均低于亲本细胞SKOV3，但是单纯从耐药指数分析，SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞对TAX的耐药性差别不明显。另外，通过倒置相差显微镜观察两种细胞的形态学差异，发现SKOV3/TS-1细胞具有明显的伸展性，且细胞体积和形态较为均一；而SKOV3/TS-2细胞则悬浮于三维支架载体中，大多呈抱团生长，细胞间连接更为紧密，含有丰富的胞间连接、中间连接、桥粒等结缔组织[12]，这可能也是导致细胞耐药的重要原因之一。而且考虑到二维培养的SKOV3/TS-2肿瘤细胞虽然增殖迅速，但短期内易退化死亡，而SKOV3/TS-1细胞不易过度生长，说明三维培养环境可以为肿瘤细胞提供更大的生长空间。

此外，本研究进一步观察SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞对其他化疗药物的交叉耐药性，结果显示，SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞对CTX、L-OHP、GCB、MIT均有一定的耐药性，且SKOV3/TS-2细胞的耐药性高于SKOV3/TS-1细胞。推测可能是由于三维培养系统得到的SKOV3/TS-2细胞的生长周期多停滞在G1期，导致细胞分裂增殖活跃度显著降低，早期凋亡率大大增加；同时肿瘤细胞也丧失了大量化疗药物作用靶点，使得细胞向耐药表型转化[13]。在本研究中，SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞TUBB3 mRNA和MDR1 mRNA表达量均高于SKOV3细胞。P-糖蛋白(Permeability glycoprotein，P-gp)是一类跨膜糖蛋白分子，因其可以利用ATP水解释放的能量促使众多化疗药物排出细胞外，因此是目前医学界普遍认可的多药耐药分子之一，被认为是MDR1基因编码的能量依赖型药泵[14]。而TUBB3是影响α、β微管蛋白动态平衡、微管二聚体重聚的重要分子[15]。在本研究中SKOV3-TS细胞TUBB3 mRNA表达量升高，说明微管蛋白的动力学活性最高，从而逆转了TAX抑制微管聚合的作用，导致细胞对TAX产生耐药性。

综上所述，三维培养系统构建的SKOV3/TS-2细胞模型与二维培养系统得到的SKOV3/TS-1细胞相比，形态结构和生物学特性都显示了较大差异，这可能是诱导SKOV3/TS-2细胞产生较强多药耐药的作用机制之一。此外，SKOV3/TS-1细胞和SKOV3/TS-2细胞中多药耐药相关基因TUBB3mRNA和MDR1mRNA表达量均显著上调，这可能与细胞产生交叉耐药有关，但其相关的作用机制尚需进一步研究。