Napabucasin对结直肠癌细胞增殖及迁移的影响

徐树涛， 彭 锐， 邹方东

(四川大学生命科学学院， 成都 610065)

1 引 言

结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)是一种严重的恶性肿瘤，严重危害身体健康[1].据报道，全球每年约有53万患者死于该疾病[2].目前对于结直肠癌的治疗仍然是以手术为主，放化疗经常被用于结直肠癌患者的晚期治疗，但是仍然有约一半的患者在接受治疗后死亡[3].因此需要更有效的方法及药物来治疗这种疾病.

结直肠癌细胞的恶性程度与信号传导及转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的活性密切相关[4].STAT3蛋白是一种致癌转录因子[5]，在乳腺癌[6]、卵巢癌、血液病[7]以及肝癌等多种肿瘤细胞中过度活化.作为转录因子，STAT3是许多致癌途径的关键调节因子，有希望成为治疗结直肠癌的潜在靶点[8].为了抑制结直肠癌的迁移、侵袭，以及发生发展，使用特异性靶向STAT3的抑制剂可能是一种有效的治疗结直肠癌的方法.

Napabucasin是能够靶向于STAT3的小分子抑制剂，抑制STAT3驱动的基因转录[9]. Napabucasin在胃癌[10]、前列腺癌[11]、非小细胞型肺癌[12]等癌症中发挥抑制肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)自我更新的作用，还可诱导这些癌细胞发生凋亡.正因为以STAT3为靶点的靶向治疗具有光明前景以及Napabucasin在这些肿瘤治疗中的良好效果，我们期望通过研究Napabucasin对结直肠癌细胞在增殖以及迁移等方面的影响，来初步分析靶向STAT3抑制剂的作用机理及其有效性，以期实现STAT3抑制剂早日广泛应用于临床，为结直肠癌患者的临床治疗提供更多的选项.

2 材料与方法

2.1 材 料

人结肠癌细胞系HCT116，DLD1购于上海中科院细胞库，人结肠癌细胞系RKO则为张林教授(匹兹堡大学)馈赠；小分子抑制剂Napabucasin购买自Selleck公司(中国上海蓝木化工有限公司)，CAS号为：83280-65-3.Wnt agonist 1购买自上海陶素生化科技有限公司，其CAS号为853220-52-7.

2.2 方 法

2.2.1 Napabucasin与STAT3蛋白的模拟对接 STAT3蛋白结构是通过swiss-model 网站预测而得.小分子抑制剂Napabucasin的3D结构是从pubchem数据库下载得到. 分子对接软件选择了开源软件Autodock4[13].

2.2.2 细胞克隆形成实验 用不同浓度的Napabucasin处理对数期生长的结直肠癌细胞，对照组加入等量的DMSO. 每隔3 d更换新鲜的完全培养基并观察细胞状态.7 d之后去除培养液，甲醇固定并用结晶紫染色，拍照后用imageJ软件进行统计分析.

2.2.3 细胞划痕实验 将对数增长期的细胞用对应浓度的Napabucasin处理24 h之后(对照组加入等量的DMSO)，按照划痕插件每个小室5×104个细胞铺板，放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养，待细胞完全贴壁之后，拔掉划痕插件，按时观察并拍照记录细胞迁移情况.用ImageJ软件测量迁移距离，计算迁移率.

3.1 Napabucasin抑制STAT3活性的机制

为了探究Napabucasin与STAT3之间的作用原理，本研究利用Autodock4软件对STAT3进行了Napabucasin小分子模拟对接.如图1A所示，Napabucasin小分子能够与STAT3蛋白中的第710位的苯丙氨酸之间形成氢键，而此位点正好位于STAT3的SH2结构域之内(图1A)，靠近重要的磷酸化位点Tyr705.所以我们推测Napabucasin可能是通过抑制STAT3的磷酸化从而抑制了STAT3蛋白的活性.在结直肠癌细胞系HCT116中，用Napabucasin处理之后，p-STAT3含量明显降低，而STAT3总蛋白含量没有明显的变化(图1B)，说明Napabucasin处理之后，确实降低了有活性的磷酸化形式的STAT3含量.

图1 Napabucasin与STAT3蛋白的Phe710结合并抑制STAT3磷酸化

3.2 Napabucasin能够抑制结直肠癌细胞的集落形成能力

为了分析STAT3对结直肠癌细胞增殖能力的影响，我们根据不同结直肠癌细胞系的IC50值，选择了不同的Napabucasin浓度来处理相应的结直肠癌细胞.如图2所示，用Napabucasin处理之后，三种结直肠癌细胞系的克隆形成能力都明显受到的抑制(P<0.05).该结果说明Napabucasin处理之后，降低了结直肠癌细胞的单细胞集落形成能力.

图2 Napabucasin对结直肠癌细胞增殖的影响A.Napabucasin处理之后，结直肠癌细胞的克隆形成能力受到了明显的抑制; B. 结直肠癌细胞形成的克隆数目统计. *P<0.05,**P<0.01，***P<0.001Fig. 2 Napabucasin inhibits proliferation of Colorectal cancer cellsA.After Napabucasin treatment,the colony forming ability of colorectal cancer cells was significantly inhibited; B. the number of colonies formed by colorectal cancer cells. *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3.3 Napabucasin能够抑制结直肠癌细胞的迁移能力

为了探究Napabucasin对结直肠癌细胞迁移能力的影响，通过划痕实验来分析Napabucasin处理后三种结直肠癌细胞迁移率的变化.结果如图3所示，与对照组相比，用Napabucasin处理后的实验组迁移率明显低于对照组，实验组迁移能力明显减弱，与对照组相比，具有显著性差异(P<0.05).本结果说明结直肠癌细胞的迁移能力都受到了Napabucasin的明显抑制.

3.4 Wnt信号通路介导了Napabucasin抑制结直肠癌细胞迁移的过程

Wnt信号通路与STAT3有很多相同的下游靶基因[14]，为了研究Wnt信号通路是否参与了Napabucasin抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭等过程.通过蛋白免疫印迹检测HCT116细胞在经Napabucasin处理之后蛋白含量的变化，发现p-GSK3β以及β-catenin的含量出现了降低(图4A).

图3 Napabucasin能够抑制结直肠癌细胞的迁移A.用Napabucasin处理之后，HCT116细胞迁移率下降了23%; B. 用Napabucasin处理之后，DLD1细胞迁移率下降了26%; C. 用Napabucasin处理之后，RKO细胞迁移率下降了27%. 图中标尺的长度为200 μm，每个处理有三个生物学重复.** P<0.01， **** P<0.0001.Fig.3 Napabucasin inhibits migration of Colorectal cancer cellsA. After treatment withNapabucasin,the migration rate of HCT116 decreased by 23%; B. after treatment with Napabucasin,the migration rate of DLD1 decreased by 26%; C. after treatment with Napabucasin,the migration rate of RKO decreased by 27%. **P<0.01,****P<0.0001.

为了验证Napabucasin处理是否影响了Wnt信号通路，我们用Wnt信号通路的激活剂Wnt agonist 1与Napabucasin共处理HCT116细胞，并观察其增殖能力.如图4B所示，当用Napabucasin 与Wnt agonist 1共处理的HCT116细胞时，与单独使用Napabucasin相比，其克隆形成数目显著增多(P<0.05).说明Wnt信号通路激活剂Wnt agonist 1恢复了部分由Napabucasin抑制的增殖能力.图4C对细胞迁移能力的实验结果也与之类似.这些实验证据表明了Wnt信号通路参与了Napabucasin抑制结直肠癌细胞迁移以及侵袭过程.

图4 Wnt信号通路介导了Napabucasin抑制结直肠癌细胞迁移及侵袭的过程A.用Napabucasin处理之后，p-GSK3β以及β-catenin的含量明显下降; B. 用Wnt agonist 1处理之后，HCT116细胞的增殖能力得到了部分恢复; C. 用Wnt agonist 1处理之后，HCT116细胞的迁移能力得到了部分恢复. *P<0.05.Fig.4 Wnt signaling mediated the Napabucasin induced the inhibition of proliferation and migration of colorectal cancer cellsA.After treatment withNapabucasin,the content of p-GSK3β and β-catenin decreased significantly; B. after treatment with Wnt agonist 1,the proliferation ability of HCT116 cells was partially restored; C. after treatment with Wnt agonist 1,the migration ability of HCT116 cells partial recovery. *P<0.05.

作为转录因子，STAT3在大量实体瘤中组成型活化[15-17].并且，STAT3的活化能够增强癌细胞活性，使许多与生存和增殖相关的基因表达上调.STAT3可以转导很多致癌信号通路中的基因表达，能够直接调节多种致癌基因的表达[18].因此，STAT3成为治疗肿瘤药物的重要靶点之一.对已有的STAT3小分子抑制剂进行研究，能够进一步的了解他们的作用机理，为临床用药提供更多的数据指导.

Napabucasin对肿瘤细胞增殖的抑制作用已有报道，研究人员用浓度为300 nmol/L，500 nmol/L的Napabucasin分别处理143B与MG63两种骨肉瘤细胞系发现，Napabucasin显著抑制了骨肉瘤细胞的增殖[19].本研究中也观察到了同样的现象，三种不同的结直肠癌细胞系(HCT116，RKO，DLD1)经Napabucasin处理之后，无论是其克隆形成的数量还是所形成克隆的平均大小，都明显减少，说明Napabucasin能够抑制结直肠癌细胞的增殖.

STAT3信号通路与β-catenin所调控的信号通路存在着很多共同的下游靶基因[14,20]，并且这些基因都能够在肿瘤的发生发展以及转移的过程中发挥重要的作用[21].在本研究中，通过蛋白免疫印迹实验发现Napabucasin在抑制了STAT3活性之后，Wnt信号通路中的β-catenin以及p-GSK3β的含量均出现了下降.而这两种蛋白均为Wnt信号通路中的关键因子[22-23].p-GSK3β的含量下降，反映了细胞内GSK3β的活性升高，造成β-catenin磷酸化后被泛素降解系统降解[24].本研究通过Wnt信号通路的激活剂Wnt agonist 1激活Wnt信号通路后发现，与单独使用Napabucasin相比，HCT116细胞的增殖能力以及迁移能力都明显增强.证明了在调控结直肠癌增殖以及迁移过程中，Wnt信号通路与STAT3信号通路存在着密切联系.而这种联系是直接联系还是间接作用，还需要进一步的实验证明.

STAT3抑制剂在治疗恶性肿瘤的增殖以及迁移等方面有着很好的应用潜力.对STAT3抑制剂的研究，有助于改善当前放化疗治疗效果不佳的现状.本研究初步探究了STAT3抑制剂对结直肠癌细胞增殖、侵袭、迁移以及与Wnt信号通路的联系等方面的影响，为在个体水平进一步探索控制结直肠癌肿瘤和转移提供了更多可能.