甜瓜VQ家族基因鉴定及白粉病菌响应分析

孙建磊 董玉梅 王崇启 肖守华 高 超 焦自高

(山东省农业科学院蔬菜花卉研究所/国家蔬菜改良中心山东分中心/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/ 农业农村部黄淮地区蔬菜科学观测实验站(山东)，山东 济南 250100)

VQ家族基因是一类植物所特有的基因，其编码蛋白包含一种由10个氨基酸残基组成的VQ保守结构域(FxxhVQxhTG，x代表任意氨基酸残基，h代表疏水性氨基酸残基)。VQ蛋白主要通过2个高度保守的氨基酸残基——缬氨酸(V)和谷氨酰胺(Q)与WRKY家族蛋白相互作用，从而调控下游一系列生理生化过程[1]。2005年，Andreasson等[2]采用酵母双杂交方法从拟南芥中鉴定到第一个VQ基因，并证明其在抵御病原菌侵害中具有重要功能。此后，越来越多的VQ家族基因在不同植物体中被挖掘。目前，在拟南芥中已鉴定到29个VQ家族基因，水稻中包含40个、玉米中包含61个、大豆中包含74个、葡萄中包含18个，白菜中包含57个[3-8]。

功能研究表明，VQ蛋白不仅参与调控植物生长发育过程，还参与植物体对各种生物胁迫以及非生物胁迫的响应过程。研究发现，拟南芥中VQ14/IKU1在种子胚乳中高水平表达，该基因作为转录因子WRKY10的辅助因子，共同调控胚乳和种子发育[9]。AtVQ29编码蛋白主要与光敏色素结合因子(phytochrome interacting factor，PIF)相互作用共同调控下游基因的表达，在幼苗光形态建成过程中具有重要功能[10]。此外，AtVQ20作为AtWRKY2和AtWRKY34的互作因子，协同调控花粉的发育、萌发以及花粉管的伸长[11]。此外，VQ蛋白还参与植物体对各种生物胁迫以及非生物胁迫的响应过程。拟南芥VQ9蛋白作为转录因子WRKY8的负调控因子，使其表达维持在适当水平，从而增强植株对盐胁迫的抗性[12]。目前越来越多的证据表明VQ蛋白在植物抵御病原菌侵染过程中也具有重要功能。如灰霉病病菌可以诱导AtVQ16和AtVQ23上调表达，分别过量表达这2个基因均能增强植株对灰霉病的抗性[13]。转录组测序数据表明水稻在受到稻瘟病菌侵染之后，OsVQ22表达水平明显升高，表明该基因参与了水稻对稻瘟病的抗性[14]。

越来越多的VQ家族基因在不同植物中被挖掘，进一步的研究也证明这些基因编码的蛋白在植物体内发挥着各种各样的功能。然而，甜瓜(CucumismeloL.)中VQ家族基因的鉴定及相关功能研究尚鲜见报道。甜瓜基因组序列测序的完成，使得从全基因组层面对甜瓜基因家族进行系统研究成为可能[15]。本研究采用生物信息学的方法对甜瓜VQ家族成员进行鉴定，并对其编码蛋白的基本信息、基因结构、保守motif、系统进化关系、组织器官表达特征和白粉病菌侵染下的响应等进行分析，以期为进一步研究VQ家族成员在甜瓜正常生长发育过程及逆境胁迫条件下的分子功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 甜瓜VQ家族基因鉴定及系统进化分析

从甜瓜基因组数据库(http://cucurbitgenomics.org/organism/3)下载所有预测蛋白序列文件，并从pfam数据库下载VQ结构域Hidden Markov Model (HMM)序列 (PF05678)。然后，采用HMMER3进行本地BLAST，E-value设置为1×10-3。最后，采用NCBI保守结构域数据库和SMART数据库对甜瓜候选VQ蛋白进行结构域验证并用于后续分析。从拟南芥基因信息数据库TAIR(http://www.arabidopsis.org)获得所有VQ蛋白序列，采用Clustal Omega在线软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)将29个拟南芥VQ蛋白序列和26个甜瓜VQ蛋白序列进行多重序列比对，使用MEGA7.0软件，选用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统进化树，校验参数为Bootstrap=1 000[16]。

1.2 甜瓜VQ家族成员生物信息学分析

甜瓜VQ基因内含子、外显子和基因组定位信息均来自于葫芦科作物基因组数据库CGD(http://cucurbitgenomics.org/)。运用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在线工具分析甜瓜VQ家族成员的分子量和等电点；利用在线工具MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)鉴定蛋白保守基序，其参数设置基序数量12个，其余参数均为默认[17]。

1.3 甜瓜种植、白粉病菌侵染及取样

以栽培甜瓜M1为材料，播种于人工气候室内，光周期设置为16 h/8 h(光照/黑暗)，昼夜温度设置为28°C/22°C。当植株生长至2～3片真叶时，采用白粉病菌孢子悬浮液喷雾法人工接种白粉病菌促使植株发病，接种孢子浓度为1×106个·mL-1，接菌后黑暗培养12 h，湿度保持在75%以上[18]。分别于接菌后0、24、48、72 h收集植株的叶片组织，每个时间点设置3次生物学重复。样品于液氮中速冻后保存于-80℃低温冰箱中备用。

1.4 甜瓜VQ家族基因组织表达分析

甜瓜VQ家族基因在不同组织中的表达数据(FPKM值)从甜瓜功能基因组数据库(http://gene.melonet-db.jp/cgi-bin/melview.cgi)获得。首先将基因表达数据统一标准化为log2(FPKM value+1)，然后采用R软件(http://www.r-project.org/)绘制甜瓜VQ基因在13个不同组织的表达热图。

1.5 RNA提取及实时荧光定量PCR分析

采用Trizol法提取样品总RNA，并采用TaKaRa公司(大连)反转录试剂盒参考说明书反转录成cDNA。实时荧光定量PCR反应采用Roche SYBR Green Master法。反应体系包括5 μL SYBR Green Master MIX、上下游引物各1 μL、1 μL cDNA 和2 μL ddH2O。反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，40个循环；设置3次重复。以甜瓜Actin为内参基因，采用2-ΔΔCt方法[19]计算基因的相对表达量。实时荧光定量PCR所用引物见表1。

表1 实时荧光定量PCR所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primer sequences used for quantitative RT-PCR

2 结果与分析

2.1 甜瓜VQ家族基因鉴定及编码蛋白特征分析

为了对甜瓜VQ家族基因进行全面系统的分析，以VQ蛋白保守结构域序列(PF05678)为参考，从甜瓜全基因组水平进行VQ家族基因和蛋白的挖掘。由表2可知，试验总共鉴定到26个甜瓜VQ基因，这些基因不均等地分布在除09号染色体外的11条染色体上。结构分析表明，甜瓜VQ基因均不包含内含子，由单个外显子组成。该家族基因编码蛋白长度在81～413氨基酸残基之间；最小蛋白分子量为9.25 kDa，最大蛋白分子量为43.53 kDa；等电点在4.59～11.29之间。07和08号染色体上分别含有6个VQ基因。

表2 甜瓜VQ家族成员基本信息Table 2 The basic information of VQ family gene in melon

2.2 甜瓜VQ家族蛋白序列比对及系统进化分析

蛋白序列比对分析结果表明，甜瓜VQ蛋白均含有保守的FxxhVQxhTG结构域，其中21个蛋白保守结构域为FxxhVQxLTG，其他5个蛋白保守结构域为FxxhVQxFTG(图1)。为了进一步明确甜瓜VQ家族基因的进化关系，将甜瓜VQ家族蛋白与拟南芥、水稻、玉米VQ家族蛋白进行了系统进化分析(图2)。根据前人研究中拟南芥、水稻、玉米聚类分析结果，甜瓜VQ家族蛋白可分为7个亚家族(Ⅰ～Ⅶ)。其中，亚家族Ⅲ含有6个甜瓜VQ蛋白，亚家族Ⅳ和Ⅴ均含有5个甜瓜VQ蛋白，亚家族Ⅱ含有4个甜瓜VQ蛋白，亚家族Ⅶ含有3个甜瓜VQ蛋白，亚家族Ⅵ含有2个甜瓜VQ蛋白，亚家族Ⅰ含有1个甜瓜VQ蛋白。同一个亚家族内的基因(蛋白)往往具有较高的同源性和相近的进化关系，同时具有相似的分子功能。

图1 甜瓜VQ家族蛋白VQ基序多重比对分析Fig.1 Multiple sequence alignment of the VQ motif in melon VQ proteins

2.3 甜瓜VQ家族蛋白保守motif分析

保守motif的数量和类型决定了VQ蛋白具有不同的分子功能。为了进一步揭示甜瓜VQ家族蛋白分子功能，对甜瓜VQ家族蛋白中的保守motif进行了预测分析。由图3可知，甜瓜VQ家族蛋白最少含有1个保守motif，最多含有6个保守motif。此外，motif 1、2、5、11在甜瓜VQ家族蛋白中分布比较广泛，表明这些motif可能在甜瓜生长发育及响应逆境胁迫中发挥重要功能。

2.4 甜瓜VQ家族基因组织表达分析

基因家族不同成员功能发挥和其表达模式密切相关。目前，随着第二代高通量测序技术的发展，甜瓜不同组织及不同发育时期所有基因的表达数据已在甜瓜功能基因组数据库公开，为不同家族基因的组织表达特征分析提供了基础。本研究初步分析了26个甜瓜VQ家族基因在13种不同组织及不同发育时期的表达情况。由图4可知，除了MELO3C008397和MELO3C003285在不同组织均未被检测到之外，其他24个基因均在甜瓜中表达且具有不同表达模式。其中，MELO3C013853在所有组织中均具有较高的表达水平，MELO3C023436和MELO3C016694在除种子以外的其他组织中均具有较高表达水平；而MELO3C017312和MELO3C010713仅在种子中特异表达，MELO3C009629、MELO3C004409、MELO3C016231仅在根中特异表达，MELO3C009575仅在花药中特异表达，MELO3C016156仅在成年叶中具有较高表达水平；MELO3C011042在子房中表达水平明显高于其他组织，MELO3C003409在根、茎、叶、花中表达水平较高，MELO3C003561在根、叶、须、雌花花瓣、果皮及种子中均高水平表达，MELO3C016947在成年叶和种子中具有较高表达水平，MELO3C017584在根、茎、幼叶、子房和果皮中表达水平明显高于其他组织，MELO3C026380在花、果肉和种子中表达水平明显高于其他组织，MELO3C007028在根、成年叶和雌花中表达水平明显高于其他组织，MELO3C007278在根、茎、幼叶、卷须和子房中表达水平明显高于其他组织。

2.5 甜瓜VQ家族基因白粉病菌响应分析

VQ家族蛋白作为WRKY家族转录因子的辅助因子参与多种生物及非生物胁迫的响应过程。为了揭示VQ家族基因在甜瓜抗白粉病中的功能，本研究对甜瓜叶片中VQ家族基因在白粉病菌侵染后的表达变化进行了分析。甜瓜幼苗在白粉病菌侵染后第7天出现白粉病表型，而清水处理植株无发病表型(图5-A)。与对照(清水处理)相比，MELO3C016947和MELO3C016156在白粉病菌侵染24 h后出现显著上调表达，MELO3C019076在白粉病菌侵染48 h后出现显著上调表达，表明这3个VQ基因在甜瓜抵御白粉病菌侵染过程中起负调控作用；MELO3C016694、MELO3C023436、MELO3C023257和MELO3C013853在白粉病菌侵染24 h后出现显著或极显著下调表达，MELO3C007278在白粉病菌侵染48 h后出现极显著下调表达，表明这些VQ家族基因在甜瓜抵御白粉病菌侵染过程中起正调控作用(图6)。

图2 甜瓜VQ家族蛋白与拟南芥、水稻、玉米VQ家族蛋白系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of VQ proteins in melon, Arabidopsis, rice and maize

图3 甜瓜VQ家族蛋白保守motif分析Fig.3 Conserved motif of VQ family proteins in melon

图4 甜瓜VQ家族基因在不同组织中的表达分析Fig.4 The expression patterns of VQ family genes in different tissues of melon

注：A: 清水处理植株表型；B: 白粉病菌处理植株表型。Note: A: The phenotype of melon seedlings treated with water. B: The phenotype of melon seedlings infected with powdery mildew.图5 白粉病菌侵染后甜瓜幼苗发病表型Fig.5 The phenotype of melon seedlings after powdery mildew infection

注：*和**表示各处理间差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。Note: * and ** mean the signifcant difference among different treatments at 0.05 and 0.01 level, respectively.图6 8个甜瓜VQ基因白粉病菌响应分析Fig.6 Differential expression patterns of nine VQs response to powdery mildew infection

3 讨论

甜瓜属葫芦科一年生二倍体植物，其果实香脆清甜、风味独特、营养物质丰富，是一种世界范围内广泛种植的经济作物。然而，当前的甜瓜主栽品种在生产中极易受到白粉病侵害，严重制约了甜瓜的生长发育和产量的形成[20-23]。因此，挖掘甜瓜抗白粉病基因并揭示其抗病分子机制已成为甜瓜抗病领域研究的热点。为了研究甜瓜中VQ家族基因的具体功能，本研究采用生物信息学方法从甜瓜基因组水平鉴定到26个VQ基因。该数量与拟南芥中VQ基因数量基本一致，但明显少于玉米(41)和大豆(74)中VQ基因数量，这可能与其基因组大小差异及基因组复制事件有关。玉米基因组大约为2 500 Mb，是拟南芥基因组大小的20倍、水稻基因组的6倍，大约编码50 000个基因[8]。大豆基因组大约为1 100 Mb，其基因组在进化过程中经过了2次复制过程以及大量的基因复制事件，从而导致大豆基因组中75%以上基因为多拷贝基因[5]。甜瓜基因组大小为375 Mb，编码27 000 个基因[15]。同时，甜瓜中大部分基因为单拷贝基因，导致甜瓜VQ基因数目明显少于玉米和大豆中VQ基因数目。

本研究结果表明，26个甜瓜VQ基因均不包含内含子，该结果与其他植物如拟南芥[3]、水稻[4]、大豆[5]、葡萄[6]等中基因结构分析结果基本一致。拟南芥和水稻中VQ基因均不包含内含子，同时玉米和葡萄中大部分VQ基因不包含内含子序列，仅有6个玉米VQ基因包含1或2个内含子，葡萄中仅有1个VQ基因含有1个内含子。以上结果表明，VQ家族成员基因结构在不同物种间具有高度保守性。

研究表明，拟南芥中VQ蛋白作为一种转录调控辅助因子，可与多种WRKY蛋白互作共同参与调控植物的多种生理生化过程，如种子发育和萌发，渗透胁迫及盐胁迫的响应过程以及抗病反应等[24-26]。不同物种之间具有相似或相同功能的基因往往在序列和结构上具有高度保守性，在系统进化树中的距离越近[27-30]。同时，基因在不同组织器官以及不同发育时期的表达模式与其功能的发挥有着密切联系。因此，系统进化分析和组织表达分析结果可为预测甜瓜VQ基因的功能提供一定的参考。在本研究中，序列比对结果和系统进化结果表明，MELO3C003409与拟南芥VQ家族成员AT2G41180 (AtVQ16/AtSIB1)直系同源。该基因在拟南芥中编码一个Sigma蛋白结合因子，并与AtWRKY33蛋白的C端相互作用，在抵御灰霉病过程中发挥重要功能。表达分析表明，MELO3C003409在甜瓜根、茎、叶、花中表达水平较高，推测其在甜瓜植株抵御病害过程中发挥着重要功能。此外，甜瓜MELO3C023436与拟南芥AT1G78310 (AtVQ9)直系同源，研究证明，AtVQ9通过与WRKY8的互作抑制后者与W-box的结合活性，从而负调控植物抗盐性[12]。本研究中，MELO3C023436在除种子以外的甜瓜其他组织中均具有较高表达水平，推测其在甜瓜响应高盐胁迫过程中发挥相似的功能。

Wang等[6]研究表明葡萄植株在白粉病菌侵染之后，5个VQ家族基因上调表达，3个VQ家族基因表达明显下调，该结果第一次表明VQ家族成员响应白粉病菌侵害过程，为进一步研究其具体功能和抗病机理提供了基础。为了研究VQ家族基因在甜瓜抵御白粉病过程的功能，本研究采用实时荧光定量PCR研究了甜瓜VQ家族成员在白粉病菌侵染条件下的表达模式变化，结果表明3个甜瓜VQ基因上调表达，5个VQ基因表达明显下调，表明这8个甜瓜VQ基因在抵御白粉病菌侵染过程中可能发挥重要的功能。因此，根据本研究的结果应集中于甜瓜抗白粉病相关VQ家族基因进行进一步功能验证和利用，从而为甜瓜抗白粉病新品种改良提供理论支撑。

4 结论

本研究首次从甜瓜基因组中鉴定到26个VQ家族成员，命名为CmVQ，并对其基因结构、系统进化、染色体分布和表达模式进行了分析。结果显示，甜瓜VQ家族成员基因结构进化高度保守，且不均匀地分布在甜瓜11条染色体上。该家族成员编码蛋白可分为7个亚家族，表明甜瓜VQ不同成员间具有不同生物功能。组织表达谱分析表明23个甜瓜VQ家族基因组织特异性表达，仅1个甜瓜VQ家族基因组成性表达。此外，白粉病菌侵染之后，6个甜瓜VQ家族基因呈现不同程度的响应，推测其在甜瓜抵御白粉病侵染过程中发挥重要功能。本研究结果为进一步研究甜瓜VQ家族基因在抗白粉病中的功能奠定了基础。