从相关到因果：运动与肠道菌群--肠--脑轴

杜然浩，宋 刚*，赵吉春

机体微生物与人是一种共生关系，在一定的条件下通过互相作用实现共同生存。大部分菌群存在于肠道中，构成肠道菌群这一复杂系统。肠道菌群与宿主健康之间的关系，一直是生命科学研究的热点。目前，运动与肠道菌群-肠-脑（microbiota-gutbrain，MGB）轴之间的研究引起了研究者的兴趣，并取得了一定数量的成果。需要指出的是，运动与MGB轴的研究不够深入，很多情况下都只发现了相关性的证据，缺少因果关系（Brunkwall et al.，2017）。本文对运动与MGB轴研究的因果范式进行了梳理。

1 肠道菌群--肠--脑交互作用及可能机制

人类很早就知道肠道菌群能够影响大脑生理和行为。黄帝内经有“心合小肠”的表述，中医据此总结出“心与小肠相表里”的理论并用于实践（李艳等，2019）。西方医学奠基人希波克拉底提出，所有的疾病都始于肠（Gasbarrini et al.，2016）。胃肠道内的微生物群落是一个复杂的生态系统，由与宿主共生的肠道菌群组成，影响着人体的营养、代谢和免疫功能。研究表明，肠道菌群与一些复杂的疾病有关，如肥胖、糖尿病和癌症（Zitvogel et al.，2018a）而且还与精神类疾病有关，包括中风、癫痫、帕金森病、焦虑、抑郁症、孤独症和精神分裂症等疾病（Dan et al.，2020；Siopi et al.，2020；Tengeler et al.，2020；）。肠道菌群是宿主免疫稳态的中心调节因子（Levy et al.，2017；Zitvogel et al.，2018b），其失调可能参与了中枢（如多发性硬化）和外周（如类风湿关节炎）自身免疫性疾病的发病（Hindson，2017；Zhang et al.，2015）。这些研究表明，肠道菌群可通过肠-脑轴影响宿主行为（Mao et al.，2020）。MGB轴的交互作用途径包括迷走神经、肠道菌群代谢物（如神经递质和短链脂肪酸）和免疫系统等（Sherwin et al.，2016）。

1.1 迷走神经

迷走神经是人体主要的副交感神经，在调节心率、支气管收缩和肠道运动等多种器官功能方面起着关键作用。刺激副交感神经通路具有抗炎作用，能够引起促炎细胞因子的产生减少，减弱全身炎症反应（Borovikova et al.，2000）。迷走神经并不直接与肠道菌群相互作用，而是通过肠道菌群的代谢产物和肠道菌群介导的肠道上皮细胞分泌物来感知菌群信号（Bonaz et al.，2018）。研究表明，蛋白质能够通过迷走神经从肠道转运到大脑。2016年12月，Timothy发表在顶级期刊Cell上的论文报道，肠道菌群及其代谢物可通过MGB轴途径治疗帕金森症，这是帕金森症治疗的肠源性因果证据，为帕金森症的生物活性靶向药物研发指出了新的方向（Sampson et al.，2016）。小鼠的迷走神经完整，且编码α-Syn基因存在的情况下，α-Syn蛋白才能扩散到大脑。研究者观察到，α-Syn蛋白通过迷走神经扩散到大脑后，分泌多巴胺的神经元大量死亡，同时小鼠表现出类帕金森症的认知、运动功能障碍和焦虑等症状。而切断迷走神经，就可以预防上述症状出现。这项研究表明，α-Syn蛋白可以沿着迷走神经从小肠传播到大脑，阻断α-Syn传播途径可能是预防帕金森病的关键（Kim et al.，2019），α-Syn蛋白的迷走神经通路在肠-脑轴起重要作用。

1.2 肠道菌群代谢物

肠道菌群能够产生大量代谢物，主要是神经递质和短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）盐，进而影响大脑的生理和行为。神经递质主要包括去甲肾上腺素、多巴胺和γ-氨基丁酸（Taj et al.，2018）。自闭症小鼠肠道菌群中的双歧杆菌属和布劳特氏菌属细菌水平较低，伴随着肠道色氨酸和胆汁酸分泌不足，二者都负责生成血清素这一神经递质（Golubeva et al.，2017）。同样肠道菌群失调的现象也在人体实验中发现，自闭症儿童体内的韦荣氏球菌、粪球菌和普雷沃菌水平均低于正常儿童（Kang et al.，2013）。短链脂肪酸代谢物（如丁酸盐、丙酸盐、乙酸盐和戊酸盐），可以通过其同源的游离脂肪酸受体（free fatty acid receptor，FFAR）调节各种生理功能。FFAR在迷走神经中有表达，部分介导SCFA的作用。研究发现，SCFA影响中枢生理过程，比如乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的混合物能够修复无菌小鼠中观察到的小胶质细胞形态缺陷（Erny et al.，2015）。体外实验发现，PC12细胞（分化为神经元样细胞的大鼠成神经细胞）用丙酸和丁酸处理可增加酪氨酸羟化酶（去甲肾上腺素和多巴胺合成中的限速酶）的表达（Nankova et al.，2014）。需要特别指出的是，微生物代谢产物的半衰期很短（25 min至3 h），尚不清楚这些微生物代谢产物是否能够调节体内神经传递。对脑部生理和行为影响的研究通常使用的外源性SCFA浓度远远超过微生物来源的浓度（MacFabe et al.，2011）。因此，需要实验证据来确定肠道菌群产生的SCFA能够到达大脑。

1.3 免疫系统

免疫系统在MGB轴交互中起重要的作用。肠道菌群可能在派伊尔氏淋巴结（小肠中的可监测胃肠道菌群的淋巴结节）或肠系膜淋巴结等部位影响免疫系统。肠道菌群释放多种免疫激动剂，例如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和肽聚糖（peptidoglycan，PGN），进入血液循环，通过血脑屏障进入大脑（Arentsen et al.，2017）。无菌小鼠和经抗生素处理的小鼠都发现纹状体PGN受体的表达减少，表明大脑的蛋白表达可能对微生物很敏感。此外，这些PGN感应受体之一PGLYRP2（PGN识别蛋白2）的敲除会导致小鼠的社交能力增强，表明PGN会导致宿主的行为发生变化（Arentsen et al.，2017）。肠道菌群也可能影响免疫系统。无菌小鼠小胶质细胞对细菌LPS刺激的应答减少，同时促炎性细胞因子的产生水平降低（Erny et al.，2015）。给小鼠施用抗生素后，能重复这一结果，并在补充SCFA后恢复小胶质细胞的功能，证实了肠道菌群在免疫应答系统中起作用（Erny et al.，2015）。已经证明，干扰小胶质细胞-神经元的沟通（Zhan et al.，2014）和小胶质细胞的耗竭（Nelson et al.，2017）均会损害小鼠和大鼠的社交行为。要指出的是，小胶质细胞在神经行为中发挥的作用，尚不为人所知。

2 运动与肠道菌群--肠--脑轴

2.1 常见菌群研究因果推断的方法

随机双盲对照试验和基于科赫法则的多重确证试验是微生物研究常见的因果推断研究方法。

随机双盲对照试验已被国际上公认为临床防治性研究方法的金标准，通过随机化控制变量X，实现对变量Y进行因果推断。随机双盲对照试验是一种衡量时间序列之间影响，对统计指标方差变化比较进行因果推断的方法。这一点与经济学领域的格兰杰（2003年诺贝尔经济学奖得主）因果关系检验方法类似（潘朝顺等，2004）。科赫法则由德国微生物学家罗伯特·科赫提出，其主要内容是：1）在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者体内不存在；2）从宿主分离出这样的微生物，并在培养基中得到纯培养；3）用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的宿主，同样的疾病会重复发生；4）从试验发病的宿主中能够再度分离培养出这种微生物。如果进行了上述4个步骤，并得到了确实的证明，就可以确认该生物即为该病害的病原物（Finlay，2020）。科赫法则是确认特定的病原菌与疾病因果关系的重要评判标准。

2.2 运动与肠道菌群互相作用的因果证据

运动是良医，适宜运动能够有效防治多种慢性疾病的发生，包括肥胖、高血压、抑郁症、糖尿病、呼吸系统疾病、心血管疾病等，这些慢性疾病大部分被发现与肠道菌群紊乱有关。这让人猜测，运动是否与肠道菌群存在关联。通过检索，相关关系的研究较多，但因果关系的证据只有2项。2019年6月，Nature Medicine上的报道证实了肠道菌群与耐力运动能力之间的因果关系。最初的相关性证据来自对马拉松运动员粪便进行16S rDNA基因测序，发现运动后被试肠道中韦荣球菌属细菌相对丰度明显增加。因果关系证据来自将该菌分离，并接种到大鼠肠道中，可显著延长大鼠的跑步力竭时间。可能的通路途径是韦荣球菌丰度的增加，促进乳酸代谢，延长了大鼠力竭跑步时间。证实了因果关系后，再对肠道菌群代谢通路进行研究。对87名优秀运动员的粪便进行宏基因组测定，结果发现，运动后韦荣球菌将乳酸代谢为丙酸的甲基丙二酰辅酶A通路基因丰度上升。用同位素标记乳酸盐进行代谢动力学途径验证，发现血清中的乳酸盐可以穿过上皮屏障进入肠腔，进而肠道菌群分解乳酸，表明运动后血液中积累的乳酸可以运输到肠道。血清乳酸可跨越肠上皮屏障进入肠道，对结肠内灌注丙酸也可延长大鼠力竭跑步时间，表明韦荣球菌通过将运动生成的乳酸代谢为丙酸，实现运动能力的增强（Scheiman et al.，2019）。这项历时3年多的实验，从相关性出发寻找因果证据，步步深入，最后证实了对耐力运动起作用的韦荣球菌及其作用的代谢途径。另一项因果证据显示，运动是治疗糖尿病的重要手段，但不同患者对运动的反应差异由肠道菌群造成。2019年12月，Cell Metabolism在线发表了香港大学徐爱民团队的研究，其论证过程也是先进行相关性证明。12周的一对一运动训练干预对70%被试（前驱糖尿病患者）的糖稳态和胰岛素敏感性的改善具有作用，这种改善作用与肠道菌群及其代谢变化密切相关，这些人被称为运动响应者，余下的30%被试糖稳态和胰岛素敏感性变化较少，被称为非响应者。12周运动训练后，运动响应者和非响应者的肠道菌群组成和功能变化存在显著性差异。其因果证据来自将两者粪便分别移植肥胖小鼠模型，运动响应者移植小鼠胰岛素敏感性提高，而非响应者却没有变化，并出现了胰岛素抵抗，额外补充短链脂肪酸，糖代谢紊乱状态得到逆转（Liu et al.，2020）。这两项来自顶级期刊的因果证据表明，运动具有调节肠道菌群达到调节生命活动的作用。

2.3 运动与肠道菌群-肠-脑轴

运动与肠道菌群-肠-脑轴的随机对照实验证据并不多。如表1所示，Kang等（2014）将小鼠随机分为运动组（n=10）和对照组（n=10），进行2周的训练适应期，运动方案为速度从3 m/min的跑步逐渐增加到7 m/min，运动时间从每天持续时间6 min增加到60 min。小鼠适应运动方案之后，将运动组放置在车轮中60 min（7 m/min），持续5天/周，共运动16周。结果，运动使小鼠肠道菌群中硬壁菌门丰富度增加，拟杆菌门丰富度减少，这些变化进而改善了小鼠的焦虑状况，且小鼠记忆力得到了提升。Johannesson等（2011）对102名肠易激综合征患者制订了运动方案，每周进行3～5天的中强度到高强度体力活动，共12周。研究发现，肠易激综合征患者的胃肠道症状得到改善，抑郁、嗜睡状况得到好转，且患者压力也得到了缓解。Dong等（2020）也发现，食用富含双歧杆菌BB-12的酸奶能通过调节肠道菌群乳酸菌和双歧杆菌的丰度，进而降低跳水运动员“Choking”现象。这些研究表明，运动通过MGB轴参与机体功能改善的调节。

从表1随机对照实验的结果来看，运动对肠道菌群-肠-脑轴的影响是一种因果效应。目前，肠道菌群-肠-脑轴直接影响运动的研究较少，在实践中可以通过服用功能性食品（如益生元、益生菌等）对菌群调节得到一些间接性的实验证据。若要证实肠道菌群-肠-脑轴对运动的影响，要按照随机对照实验进行实验设计，控制无关变量，再对肠道菌群-肠-脑轴进行干预，观察与运动相关的结局指标。目前，这方面的研究较少，开展实行的难度也较大。

3 肠道菌群因果推断研究方法

3.1 无菌动物、伪无菌动物模型和粪菌移植

2006年，Jeffrey Gordon团队将肥胖病人的菌群移植给无菌小鼠，无菌小鼠出现了肥胖（Turnbaugh et al.，2006）。随后他们设计了一项符合科赫法则和病因研究模式的实验，来证实肥胖与肠道菌群之间的因果关系，具体方法是将一对胖瘦体型差异较大的同卵双胞胎姐妹的粪便，分别转移到无菌小鼠体内，正常饮食，不久小鼠分别出现与粪便来源相同胖或瘦的体型。这项研究表明，肠道菌群携带了肥胖宿主的某些特征菌群，能够导致小鼠出现肥胖（Ridaura et al.，2013）。无菌动物最重要的作用是把病因和结果做了直接联系。无菌动物制备并不简单，是该研究的关键限制性因素。无菌环境下，提前一天无菌剖腹产获得无菌的仔鼠，构建无菌小鼠。正因为制备无菌小鼠的条件非常苛刻，限制了它的应用。因此，用广谱的抗生素处理制备伪无菌小鼠模型就有了市场。Piewngam等（2018）发表于Nature期刊的粪菌移植和伪无菌小鼠构建方法值得我们借鉴。

表1 运动与肠道菌群--肠--脑轴的实验证据Table 1 Experimental Evidence of Exercise and MGBAxis

近年来，FMT在临床上主要是治疗由肠道菌群失调引起的各种肠道疾病，该方法可以使患者的病情得到极大缓 解 或 治愈（Davidovics et al.，2019；Hibbard et al.，2019；Hvas et al.，2019；Kim et al.，2019）。一般分为人对人、人对动物和动物对动物的FMT。

动物对动物的FMT是在粪菌移植前，首先制备粪菌移植菌液。选取健康适龄小鼠作为供体，收取新鲜排出的小鼠粪便，对新鲜粪便进行称重，再用生理盐水等溶液对其稀释，研磨后过滤粪便残渣，将所得新鲜粪菌液混合，冷冻保存用于粪菌的移植。移植时需将每只小鼠分别转移到单独的笼中，用灌胃针吸取过滤后新鲜菌液，以灌胃的方式注入小鼠胃内，每只小鼠灌入实验所需量的新鲜菌液，灌胃后观察一定时间，再将实验小鼠合笼饲养（杨沫，2017）。

《新英格兰医学杂志》以Brief Report形式报道，在人对人的FMT中，两例患者出现了严重的菌血症，其中一例死亡病例（Defilipp et al.，2019）。从此以后，人对人的FMT被美国食品和药物管理局叫停。尽管FMT治疗取得了一定的临床疗效，但其中哪些菌群起有效作用尚不清楚。亟待开发更有针对性的FMT，提高疗效降低风险。要指出的是，无菌动物、伪无菌动物模型和人对动物的粪菌移植，都是基于科赫法则的因果推断方法。

3.2 孟德尔随机化

孟德尔随机化（mendelian randomization，MR）是遵循孟德尔遗传定律——亲代等位基因随机分配给子代，以遗传变异作为工具变量，以此推断观察性研究中暴露因素与研究结局的因果关联。该方法是因果推断的有力工具（Emdin et al.，2017）。肠道菌群研究领域最具影响力的研究是证明了肠道菌群与糖尿病之间存在因果关系。Cisca Wijmenga和Mark McCarthyl对大样本被试进行多组学测定，再进行双向孟德尔随机化分析，发现肠道菌群和特定代谢产物与人体糖尿病有因果关系。她们采用反方差加权检验来确定245个微生物组特征和17个感兴趣的性状之间的因果关系，采用双样本双向MR分析，用全基因组关联分析分别对来自微生物组特征和来自代谢/人体测量性状进行汇总分析。在主成分分析和聚类分析的基础上进行微生物组学、代谢组学和人体测量，显著性水平采用保守的多重检验调整P＜1.3×10-4。最后，在英国生物银行（UK Biobank）验证这些因果关系。该研究方法和结果对肠道菌群与宿主疾病之间的研究具有重要的参考价值（Sanna et al.，2019）。该研究首次发现，肠道细菌与人类胰岛素抵抗和2型糖尿病之间的因果关系。做为一种因果推断方法，孟德尔随机化也在与时俱进。2020年5月25日，Nature Genetics报道，美国芝加哥大学贺信团队和统计遗传学家Matthew Stephens合作，极大地降低了孟德尔随机化假阳性率（Morrison et al.，2020）。

4 结论与展望

4.1 运动与肠道菌群-肠-脑轴研究亟需多学科结合应用和肠道菌群结构深入分析的突破

肠道菌群作为一个复杂系统，MGB轴是外周与中枢的交互双向交流，需要利用多组学、纳米技术、成像学、人工智能等复杂系统科学的诸多前沿方法结合开展研究。比如活体脑成像技术可用于研究脑、肠和肠道菌群之间的相互作用；正电子发射断层成像、核磁共振成像等技术的发展加深了对脑区和脑网络结构、功能和代谢特点的认识（Mayer et al.，2019）。杨朝勇和谭蔚泓研发出一种新肠道菌群活体成像方法，对于肠道菌群测定有了实时性的突破。基于近红外光谱的代谢标记方法为观察体内深部组织中的微生物提供了一条途径（Wang et al.，2020）。另外，也要深入研究肠道菌群的结构变化与人体健康之间的关系。以色列魏茨曼科学研究所科学家发现，肠道菌群结构的变化与宿主的健康有关，同一菌株之间的一些关键表型变化可能是由某些基因的差异引起的。他们提出并鉴定了微生物基因组结构变异（structural variants，SVs）这一概念，发现SVs存在于人类的肠道菌群的门级水平。同时发现SVs与宿主疾病之间存在联系（Zeevi et al.，2019）。这项研究为将来的运动与MGB轴研究从相关到因果关系提供了新的方向。

4.2 运动与肠道菌群-肠-脑轴的因果性研究亟需因果推断方法学的突破

运动与MGB轴因果论证离不开人类科研方法学的突破。目前这个研究领域已经具有因果推断能力的方法分别是基于时间的随机对照试验、横断面研究的孟德尔随机化和基于科赫法则的（伪）无菌动物和FMT因果推断。具有因果推断科研方法的突破最有可能的领域是人工智能领域。Pearl等（2018）认为，人工智能从诞生伊始，只是进行概率推理的研究方向，而因果推理将对人工智能产生革命性的跃迁。话音刚落，2019年10月，华裔科学家李飞飞首次实现了人工智能领域的因果推断（Nair et al.，2019）。人工智能方法已经深入菌群研究，比如2020年2月20日，顶级期刊Cell封面报道，用人工智能迅速挖掘出了一个全新的抗生素，短短几天内从超过1亿个分子的库中筛选出强大的新型抗生素（以前需要十几年）（Stokes et al.，2020）。不久，2020年5月28日，Cell又封面报道，利用纵向多组学（血代谢组、脂质组、免疫组、蛋白质组、转录组和肠道微生物组）对急性运动分析，通过机器学习构建了对最大摄氧量预测的人工智能模型。其中预测模型指标包括丁酸弧菌属（Butyricimonas）（属级水平的肠道细菌）（Contrepois et al.，2020）。基于这些研究，人工智能领域的因果推断这一重大突破，可能将在未来为运动与MGB轴的研究提供因果方法学的新工具。