氯普鲁卡因通过调控lncRNA EZR-AS1表达对肺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响

程栋 韦玲 刘焕

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，2018年约有210万新病例和180万死亡病例[1]。因此，迫切需要确定肺癌发展的潜在机制，并开发新的诊断性生物标志物和治疗策略。研究表明，氯普鲁卡因(chloroprocaine，CP)可抑制宫颈癌CaSki和HeLa细胞的增殖[2]，还可抑制乳腺癌细胞活性[3]。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)EZR反义RNA 1(EZR antisense RNA 1，EZR-AS1)在乳腺癌组织和细胞中上调表达，干扰其表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[4]。但氯普鲁卡因和EZR-AS1对肺癌细胞增殖、迁移侵袭的影响，且氯普鲁卡因是否通过调控EZR-AS1的表达影响肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭目前还尚未可知。本研究考察氯普鲁卡因在肺癌细胞增殖、迁移侵袭中的作用，并结合EZR-AS1探索其潜在的作用机制，为扩大氯普鲁卡因的临床用途提供线索。

资料与方法

一、主要试剂

肺癌细胞株A549购自中国典型培养物保藏中心细胞库，RPMI-1640培养基(Roswell Park Memorial Institute)购自美国Gibco公司，氯普鲁卡因购自山西晋城海斯制药有限公司，实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)相关试剂盒购自日本Takara公司，细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloprotease-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloprotease-9，MMP-9)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Abcam公司，si-NC、si-EZR-AS1、pcDNA、pcDNA-EZR-AS1购自上海吉玛生物有限公司。

二、细胞培养与处理

将A549细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养，并在37℃、含5% CO2的环境中生长。收集对数生长期的细胞，使用1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L浓度的氯普鲁卡因[4]处理细胞72 h，记为CP-L、CP-M、CP-H组，同时将正常培养的细胞设为对照(Con)。

三、噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)检测细胞增殖

将A549细胞接种于96孔板，每孔5×104个细胞。将MTT溶液(0.5 mg/mL)加入到每孔中，并将细胞培养4 h。加入二甲基亚砜以溶解所得晶体，之后在酶标仪中读取490 nm波长的吸光度(OD)值。

细胞抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%

四、Transwell检测细胞迁移侵袭

A549细胞迁移能力测定：使用无血清RPMI-1640培养基调整细胞为2×105个/mL，吸取100 μL于上室。下室加入500 μL含血清RPMI-1640培养基。细胞在培养箱中培养48 h，用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色，显微镜下观察计数。

A549细胞侵袭能力检测：除实验前在上室添加Matrigel基质胶外，其余操作均与迁移实验相同。

五、Western blot检测CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表达

收集A549细胞，在RIPA缓冲液中裂解。12 000 rpm离心15 min后，收集上清液。根据制造商的方案，通过二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白测定法确定每个样品的蛋白浓度。将蛋白溶解在十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)上样缓冲液中，100 ℃下煮沸5 min。将样品在12% SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，将PVDF膜与CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9、GAPDH抗体(1∶1 000稀释)在4℃孵育过夜。用Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween，TBST)洗涤3次后，将膜与二抗(1 ∶5 000稀释)孵育60 min。以GAPDH为对照，通过增强的化学发光液可视化目的蛋白的信号。

六、qRT-PCR检测EZR-AS1表达

根据制造商提供的方案，使用Trizol试剂从A549细胞中提取总RNA。使用Prime Script TM RT试剂盒进行逆转录，以得到cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM II PCR试剂盒进行qRT-PCR。EZR-AS1表达用2-ΔΔCt方法进行量化。用于qRT-PCR的引物如下：EZR-AS1 5'-CCCTCTCCAATGAAGCCTCTC-3'(正向)和5'-ACCGAAAATGCCGAAACCAG-3'(反向)；内参GAPDH 5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3'(正向)和5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3'(反向)。

七、细胞转染

转染前1 d，将A549细胞以适当密度接种于6孔板，待其生长至70%～80%汇合时，依照Lipofectamine 2000试剂说明书的指示，将si-NC、si-EZR-AS1、pcDNA、pcDNA-EZR-AS1转染入A549细胞。转染pcDNA、pcDNA-EZR-AS1的细胞加入2 mmol/L 氯普鲁卡因进行处理。根据1.3～1.6中所述方法，检测转染48 h后细胞增殖、迁移侵袭及相关蛋白、基因的表达。

八、统计学分析

结 果

一、氯普鲁卡因对肺癌A549细胞增殖的影响

MTT和Western blot检测结果发现，与Con组比较，不同浓度的氯普鲁卡因明显增加A549细胞增殖抑制率，显著减少CyclinD1蛋白表达量，和提高p21蛋白水平，均呈浓度依赖性(P<0.05(见表1、图1)。

图1 增殖相关蛋白表达

二、氯普鲁卡因对肺癌A549细胞迁移侵袭的影响

Transwell和Western blot检测结果表明，与Con组比较，不同浓度的氯普鲁卡因明显减少细胞A549的迁移细胞数和侵袭细胞数，以及降低MMP-2蛋白和MMP-9蛋白表达量，均呈浓度依赖性(P<0.05)(见表2、图2)。

表1 氯普鲁卡因对肺癌A549细胞增殖的影响

图2 迁移侵袭相关蛋白表达

表2 氯普鲁卡因对肺癌A549细胞迁移侵袭的影响

三、氯普鲁卡因对肺癌A549细胞中lncRNA EZR-AS1表达的影响

qRT-PCR检测数据显示，与Con组比较，不同浓度的氯普鲁卡因显著减少A549细胞中EZR-AS1的表达量，且呈浓度依赖性(P<0.05)(见表3)。

表3 氯普鲁卡因对肺癌细胞中lncRNA EZR-AS1表达的影响

四、干扰lncRNA EZR-AS1表达对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响

在A549细胞中转染si-EZR-AS1，发现EAR-AS1的表达量明显低于si-NC组(P<0.05，表4)，提示成功构建干扰lncRNA EZR-AS1表达的细胞。与si-NC组比较，干扰lncRNA EZR-AS1表达显著增加A549细胞的抑制率、p21蛋白表达量，明显降低迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白水平(P<0.05，表4、图3)。

图3 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表4 干扰lncRNA EZR-AS1表达对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响

五、lncRNA EZR-AS1过表达逆转了氯普鲁卡因(2 mmol/L)对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的作用

与Con组比较，氯普鲁卡因明显减少A549细胞的EZR-AS1表达量、迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表达量，显著提高抑制率、p21蛋白水平(P<0.05)(见表5、图4)。与CP+pcDNA组比较，CP+pcDNA-EZR-AS1组A549细胞的EZR-AS1表达量、迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1蛋白、MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表达量明显增加，抑制率、p21蛋白水平显著降低(P<0.05)(见表5、图4)。

图4 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表5 lncRNA EZR-AS1过表达逆转了氯普鲁卡因对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的作用

讨 论

在中国，肺癌是最常被诊断的癌症，也是癌症死亡的主要原因。其中，男性的肺癌发生率和死亡率几乎是女性的两倍，而不同地区之间没有显著差异[5]，中国肺癌的疾病负担仍然很高。肺癌通常在晚期被诊断出来，患者的5年生存率约为16.1%[6]。现阶段，肺癌治疗的方案已取得重大进展，但由于高度的恶性和转移性，肺癌的预后仍然不佳[7]。肺癌与其他癌症具有共同的特征，包括无限增殖，转移和侵袭，以及对细胞凋亡的抗性，而开发治疗肺癌的有效疗法面临着持续的挑战。由此，寻找新型分子生物标记物对肺癌的早期诊断，预后和潜在治疗具有重要意义。

作为临床常用麻醉药普鲁卡因的衍生物，氯普鲁卡因也称纳噻卡因，是一种氨基酯类局部麻醉剂，半衰期非常短[8]。根据报道，普鲁卡因可以抑制肺癌细胞系A549和NCI-H1975的增殖，和异种移植的肺癌小鼠肿瘤生长[9]，拥有抗肺癌、肝癌、胃癌等多种癌症的潜力[10]。氯普鲁卡因除了应用于临床麻醉外，已被报道可以抑制宫颈癌、乳腺癌细胞的增殖[2-3]，但其在肺癌细胞增殖、迁移侵袭中的作用仍不清楚。本实验中，氯普鲁卡因明显提高A549细胞增殖抑制率、p21蛋白水平，显著减少迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达量、EZR-AS1表达量，并呈浓度依赖性，说明氯普鲁卡因可以抑制肺癌细胞的增殖、迁移侵袭能力，显现出一定的抗癌活性。

lncRNA是进化上保守的转录本，没有编码蛋白质的能力。既往研究已经证明了异常lncRNA在癌症等许多复杂的人类疾病中的重要作用[11]。lncRNA涉及多种生物学功能，例如细胞周期进程，细胞生长，细胞增殖，迁移侵袭和凋亡等，与肿瘤的发生，侵袭和转移有关，在包括肺癌在内的诸多癌症中起着关键作用[12-14]。此外，癌症中异常表达的lncRNA通常充当癌基因或抑癌基因。根据报道，lncRNA EZR-AS1在结直肠癌组织中表达上调，下调其表达促进结直肠癌细胞的凋亡，抑制结直肠癌细胞的活性和侵袭能力[15]。lncRNA EZR-AS1可促进食管鳞状细胞癌细胞的迁移[16]，表明EZR-AS1可能是一种癌基因，下调其表达具有肿瘤抑制活性。本项研究分析了氯普鲁卡因对肺癌细胞中lncRNA EZR-AS1表达的影响，结果显示，不同浓度的氯普鲁卡因显著减少A549细胞中EZR-AS1的表达量，提示EZR-AS1参与氯普鲁卡因调控的肺癌进程。功能实验结果表明，干扰lncRNA EZR-AS1表达显著增加A549细胞的抑制率、p21蛋白表达量，明显降低迁移细胞数、侵袭细胞数、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平，这表明干扰EZR-AS1表达对肺癌细胞增殖、迁移侵袭具有抑制作用，与前人研究[4]相符。另外，进一步探究氯普鲁卡因的机制，发现lncRNA EZR-AS1过表达可以逆转氯普鲁卡因促进肺癌A549细胞抑制率、p21蛋白表达的作用，和逆转其抑制细胞迁移侵袭、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的作用。这些结果证实，氯普鲁卡因抑制肺癌细胞的增殖、迁移侵袭可能是通过下调lncRNA EZR-AS1表达来实现的。

综上所述，1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L浓度的氯普鲁卡因能够有效抑制肺癌细胞增殖、迁移侵袭，并且干扰lncRNA EZR-AS1表达对肺癌细胞增殖、迁移侵袭同样具有抑制作用，氯普鲁卡因对肺癌的抗增殖、抗迁移侵袭活性与调控lncRNA EZR-AS1表达有关，为肺癌的诊治提供了有前景的药物和靶点。