颗粒蛋白前体调节Th1和Th17干预柯萨奇病毒B3诱导病毒性心肌炎的实验研究

樊维娜，刘 杲，王阿丽，秦黎明，韩芳琪

病毒性心肌炎主要是由于病毒感染导致的心肌局限性和弥漫性炎症的病变，在病毒流行感染期间，会有5%的病人患有心肌炎[1]，在临床上病人的表现不同，主要有发热、咽痛、呕吐、全身酸痛等症状[2]，在此症状上会伴有呼吸困难、水肿、胸闷、胸痛，以至于阿斯综合征的发生[3]，也会有极少数人出现心源性休克和心力衰竭[4]。目前研究发现，多种病毒都会引起心肌炎的发生，比如人类肠道致细胞病变的孤儿病毒(ECHO)、脊髓灰质炎病毒及柯萨奇病毒A组、B组，柯萨奇病毒B3(CVB3)感染是导致病毒性心肌炎突发心脏病致使年轻人死亡的主要因素[5]。颗粒蛋白前体(progranulin)是一种多功能的生长因子[6]，能够调节和保护机体正常组织的发展、再生、增殖以及在身体防御过程中发挥着非常重要的作用[7]，颗粒蛋白前体具有对抗肿瘤和各种炎症的作用[8]。Th1和Th17因子参与CVB3的发展，Th1和Th17因子都属于促炎因子[9]，会诱导病毒性心肌炎的发展，本研究探讨颗粒蛋白前体调节Th1和Th17对CVB3诱导病毒性心肌炎的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与病毒 选取8周左右的雄性大鼠36只，由吉林大学动物实验室提供，按要求喂养1周后应用于实验，并随机分为空白组、CVB3组、颗粒蛋白前体组，每组12只。CVB3(Nancy株)购自美国ATCC，在Hela细胞中保存，病毒滴度用50%的组织培养传染性测定。

1.2 试剂和仪器 磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自南京建成生物工程研究所，肌酸激酶活性检测试剂盒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ 干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-7(IL-7)试剂盒购自上海苏彭化，颗粒蛋白前体购自美国Fermentas。高速冰冻离心机(美国thermo)，石蜡切片机(Tanon)，稳压稳流电泳仪(上海跃进)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立 CVB3进行扩增和繁殖，24 h后从二氧化碳(CO2)保温箱中去除，3次冻融，1 600 r/min离心30 min，把上清进行分装，保存在冰箱中。24 h后取出并稀释，把Hela细胞放入1×105的96孔板中，再将稀释的CVB3滴到Hela细胞上面，连续观察1周，细胞病变大于50%的孔为病变孔，并计算CVB3的半数组织培养感染剂量(TCID50)。空白组大鼠注射生理盐水，CVB3组和颗粒蛋白前体组大鼠注射1×103TCID50液体CVB3，7 d后建模成功，观察3组大鼠的健康状况和2周的生存情况，2周后对大鼠进行麻醉，处死，进行血清测定、组织切片、苏木精-伊红(HE)染色。

1.3.2 心脏超声检查 采用意大利百胜MyLabTmsix型彩色多普勒超声诊断仪，探头频率为6～19 MHz，对大鼠进行超声心动图检查，检查前经过异氟烷全身麻醉后，再通过超声心动图检测心脏射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)。

1.3.3 HE染色 取大鼠心肌组织切片，放入10%多聚甲醛磷酸液中固定，经脱水、透明、石蜡、包埋，HE染色，显微镜下观察心肌组织形态。

1.3.4 流式细胞仪检测Th1和Th17细胞占比 将大鼠心肌组织用胰酶消化后，进行离心处理，1 000 r/min 离心5 min，用1640培养基加入ACK裂解缓冲液，在37 ℃的环境下孵育5 min，进行离心处理，1 000 r/min 离心6 min，PBS洗涤2次，加入50 μg/mL佛波醇、1 μg/mL离子霉、10 μg/mL布雷非德菌素晃动均匀，在37 ℃的环境下孵育3 h，加入抗小鼠IL-17A单克隆抗体进行细胞染色，用流式细胞仪进行定量分析，计算Th1和Th17细胞占比情况。

1.3.5 酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、IFN-γ、IL-7表达 加入抗大鼠TNF-α、IFN-γ、IL-7，按照试剂盒的操作说明书进行操作[10]，测量的最小浓度为10 pg/mL，采用680酶标仪进行检测。

2 结 果

2.1 3组大鼠EF、FS比较 心脏超声检测结果显示，空白组中EF、FS分别为79.25%和51.22%，CVB3组EF、FS分别为59.24%和39.43%，颗粒蛋白前体组EF、FS分别为69.73%和48.89%，CVB3组EF、FS较空白组明显降低(P<0.05)，证明CVB3对心肌有一定的伤害作用，颗粒蛋白前体组EF、FS较CVB3组明显升高(P<0.05)，说明颗粒蛋白前体可改善CVB3引起的心脏功能下降，抑制心肌炎的继续发展，对心脏功能损伤具有一定的保护作用。详见图1。

与空白组比较，*P<0.05；与CVB3组比较，# P<0.05。

2.2 心肌组织HE染色结果 空白组属于正常心肌组织，细胞排列整齐，没有炎症发生；CVB3组是建模成功感染CVB3的心肌组织，出现细胞裂痕增大，心肌坏死、排列混乱、断裂；颗粒蛋白前体组采用颗粒蛋白前体干扰后，与CVB3组相比，炎性因子浸润降低，裂痕和坏死病灶逐渐减少，说明颗粒蛋白前体给药可以有效保护大鼠免受CVB3感染引起的致死性心肌炎的侵害。详见图2。

图2 心肌组织病理学形态(HE染色，×400)

2.3 3组Th1和Th17细胞占比比较 有研究表明Th1和Th17细胞能够促进CVB3引起的心肌炎的发展[11]，Th1和Th17细胞在血清水平CVB3感染中属于促炎细胞因子。CVB3组Th1、Th17细胞占比明显高于空白组(P<0.05)，颗粒蛋白前体组Th1、Th17细胞占比明显低于CVB3组(P<0.05)。说明颗粒蛋白前体可能对CVB3引起的病毒性心肌病有保护作用，通过调节Th1和Th17细胞反应诱导心肌炎。详见表1。

2.4 3组TNF-α、IFN-γ、IL-7表达比较 CVB3组TNF-α、IFN-γ、IL-7较空白组明显升高(P<0.05)，颗粒蛋白前体组TNF-α、IFN-γ、IL-7较CVB3组明显降低(P<0.05)，说明颗粒蛋白前体可以直接抑制TNF-α、IFN-γ、IL-7炎性因子表达，有效保护大鼠心肌受损。详见表2。

表1 3组Th1和Th17细胞占比比较(±s) 单位：%

表2 3组TNF-α、IFN-γ、IL-7表达比较(±s) 单位：pg/mL

2.5 3组生存率比较 空白组大鼠生存率为83.33%，CVB3组生存率为28.81%，颗粒蛋白前体组生存率为54.01%，与空白组相比，CVB3组大鼠的生存率明显降低(P<0.05)，与CVB3组相比，颗粒蛋白前体组大鼠的生存率明显升高(P<0.05)，说明颗粒蛋白前体调节Th1和Th17对CVB3诱导病毒性心肌炎具有保护作用，提高了大鼠的生存率。详见图3。

图3 3组大鼠的生存曲线

3 讨 论

CVB3诱导的病毒性心肌炎目前在临床上比较常见，严重可发展为扩张型心肌病甚至心力衰竭[11-12]。有研究报道，CVB3诱导病毒性心肌炎的存活率达到70%左右[13]，预后效果也不理想，不同病人心功能伤害程度不一，心肌炎发病一般分为两种不同的方式，第1种是病毒对心肌进行直接感染，引起心肌细胞大量损伤，第2种是病毒感染破坏免疫功能，导致心肌细胞损伤[14]，促炎因子增加，导致过激的炎症反应，心肌受损更加严重[15]。随着医疗技术的不断进步，治疗心肌炎的方法在临床上也取得了很大的进步，如常规免疫调节、抗病毒、抗心力衰竭和心律失常等[16]。本研究观察颗粒蛋白前体调节Th1和Th17对CVB3诱导病毒性心肌炎的影响。

本研究结果还显示，空白组大鼠EF、FS分别为79.25%和51.22%，CVB3组大鼠EF、FS分别为59.24%和39.43%，颗粒蛋白前体组EF、FS分别为69.73%和48.89%。CVB3组EF、FS较空白组明显降低，证明CVB3对心肌损伤有一定的伤害作用，颗粒蛋白前体组EF、FS较CVB3组明显升高，说明颗粒蛋白前体可改善CVB3引起的心脏功能下降，对心脏功能损伤具有一定的保护作用。心肌组织HE染色结果显示，空白组大鼠属于正常心肌组织，细胞排列整齐，没有炎症发生，CVB3组大鼠是建模成功感染CVB3的心肌组织，出现细胞裂痕增大，心肌坏死、排列混乱、断裂，颗粒蛋白前体组采用颗粒蛋白前体干扰后，与CVB3组相比，炎性因子浸润降低，裂痕和坏死病灶逐渐减少，说明颗粒蛋白前体给药可以有效保护大鼠免受CVB3感染引起的致死性心肌炎的侵害。有研究结果表明，颗粒蛋白前体是一种新型的分泌生长因子，能够参与多种疾病的炎症反应和免疫调节[17]。本研究结果还显示，CVB3组Th1和Th17细胞占比明显高于空白组，颗粒蛋白前体组Th1和Th17细胞占比明显低于CVB3组，通过对心肌炎性因子对比分析发现，CVB3组TNF-α、IFN-γ、IL-7较空白组明显升高，颗粒蛋白前体组TNF-α、IFN-γ、IL-7较CVB3组明显降低，说明颗粒蛋白前体对CVB3引起的病毒性心肌病有保护作用，通过调节Th1和Th17细胞反应诱导心肌炎和炎性因子的发生。有研究表明，Th1和Th17细胞具有明显的促炎作用，通过颗粒蛋白前体调节，可降低炎性因子的发生，减少心肌受损[18]。

对大鼠的生存率进行分析，正常大鼠的生存率为83.33%，被感染CVB3的大鼠生存率为28.81%，采用颗粒蛋白前体干扰被感染CVB3大鼠的生存率为54.01%，提示大鼠生存能力明显升高，证明颗粒蛋白前体抗炎作用比较明显。有研究表明，颗粒蛋白前体对抗细菌性肺炎具有明显的作用[19]。

综上所述，颗粒蛋白前体通过抑制Th1和Th17，阻止CVB3诱导的大鼠心肌炎的发生，表明颗粒蛋白前体可能是一种新的治疗心肌炎的方法。