克服阳离子困境的电荷翻转纳米载体在药物递送系统中的应用

张红艳，刘 锐，王小巍，王东凯

（沈阳药科大学 药学院，辽宁 沈阳110016）

随着纳米技术的发展，纳米制剂（NPs）在癌症治疗中发挥着越来越重要的作用。研究表明，NPs 的理化性质（如粒径、形态、所带电荷和表面特性等）对其体内的吸收、分布、渗透、代谢均起到重要作用[1]。通过对 NPs 理化性质的深入研究可设计出更理想的递药系统，例如：使体内长循环延长，对肿瘤组织渗透增强以及被肿瘤细胞摄取量提高等。

壳聚糖（CS）、聚乙烯亚胺（PEI）、细胞穿透肽以及阳离子磷脂等能够形成阳离子给药系统（polycationic drug delivery systems，PDDS），如：阳离子脂质体、固体脂质纳米粒（SLN）、正电荷胶束等。这些阳离子给药系统虽然在体外试验中效果显著，但是体内试验效果并不理想[2−4]。其原因主要有两个方面，一是由于 PDDS 能与高密度阴离子细胞膜紧密结合，使其容易受到网状内皮系统的识别并被捕获吞噬；二是 PDDS 在体内运输的过程中会被体内阴离子大分子（黏液糖蛋白、血清蛋白、细胞外基质）中的蛋白多糖和非靶细胞（如红细胞）的阴离子表面结构所消除。药剂学中，将上述出现的问题统称为 PDDS 的阳离子困境（polycation dilemma）。此外，对肿瘤微环境（TME）的深入了解，也可以阐明 NPs 的理化性质和生物活性之间的关系。本文作者对阳离子困境产生的原因、如何利用肿瘤细胞内或 TME 特有的性质（包括 pH、氧化还原、ROS 和酶等）设计智能电荷翻转纳米递送系统（charge-reversal nano drug delivery system，CRNDDS）以及电荷翻转纳米载体在化疗药物中的应用等方面的研究进行综述。

1 阳离子困境

纳米制剂静脉注射进入体内后，会在输送过程中受到很多因素的影响[5]。延长药物在血液中的滞留时间为药物提供了分布到靶部位的机会，从而延长其药理作用持续时间。体循环中存在多种负电性的生物大分子。例如：细胞质膜[6]、由蛋白多糖（如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角蛋白）组成的细胞外基质（ECM），即使是像透明质酸的非蛋白多糖也具有阴离子特性，而 ECM中最丰富的胶原蛋白也具有负电荷性质[7]。除 ECM 外，PDDS 在到达靶部位之前还会受到非靶细胞阴离子表面电荷的影响。

同样微粒表面电荷也影响药物的体内分布情况，体内的单核吞噬细胞系统具有丰富的吞噬细胞（肝脏的 Kupffer 细胞、肺部的吞噬细胞和循环系统中的单核细胞等），可以将一定大小的微粒作为异物而吞噬，递送至肝脏、脾脏。同样，NPs 所带表面电荷肯定也会影响它在体内的运输，Xiao 等[8]的研究发现带强正电荷或强负电荷的 NPs 在肝脏摄取率很高，这可能是由于肝脏中的巨噬细胞（Kupffer 细胞）主动吞噬所致。相反，当 NPs 表面电荷略为负时，肝脏摄取率很低，而肿瘤摄取率很高。所以，纳米粒子表面可以通过引入少量负电荷，减少网状内皮系统（如肝脏）的不良清除，以改善血液相容性，从而更有效地将药物输送到人体。由此可见，NPs 与体内生物大分子之间的相互作用应该受到重视。

阳离子给药系统在体内试验中的结果差强人意，很大一部分原因是由于忽视了阳离子困境，如黏液糖蛋白、血清蛋白或细胞外基质的蛋白多糖对 PDDS 的影响，而且大多数阳离子材料容易与红细胞[9]和血清蛋白发生相互作用，导致红细胞聚集和溶血，从而导致血液毒性。例如：壳聚糖等阳离子聚合物甚至被用作止血剂[10]。克服阳离子困境的策略主要是通过调节 pH、氧化还原或酶触发的电荷转换将药物输送至靶部位。pH 敏感主要是利用实体瘤、炎症组织和缺血组织等靶点的微酸性环境，例如：用2, 3-二甲基马来酸屏蔽阳离子的氨基；还原敏感主要利用二硫键连接聚合物，如在肿瘤微环境中由于谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平高，二硫键被剪切；酶敏感主要以碱性磷酸酶、基质金属蛋白酶或透明质酸酶等为靶点，通过酶切去阴离子部分，从而使电荷从负转换为正。

2 克服阳离子困境的策略

克服药物输送中阳离子困境最简单方法是用阴离子结构隐藏正电荷性质[11]，而复杂的方法是通过建立“隐身”阳离子给药系统，最终使药物安全送达到靶部位。此外，采用化学方式如低 pH、高水平谷胱甘肽（GSH）和特异性酶均可以触发药物的释放，或者通过光、温度和磁场等物理方式触发。电荷翻转纳米药物传递系统（CRNDDS）在血液循环及释药过程如图1 所示[12]。

Fig. 1 Charge reversal and drug release of the CRNDDS图 1 电荷翻转纳米给药递送系统体内释药过程

2.1 pH触发电荷翻转

pH 敏感触发制剂电荷翻转的策略已经被广泛用于药物传递系统中。研究表明[13]，正常的组织和器官与疾病状态下（如糖尿病、感染、炎症和肿瘤）相比其 pH 值有很大差异，由于肿瘤细胞的糖酵解率很高，肿瘤组织的 pH 值（5.7～7.8）低于正常组织（约 7.4），而在细胞器中，肿瘤细胞内的晚期内含体和溶酶体的 pH 值更低（4.5～5.5）。因此，从肿瘤微环境到溶酶体或内含体中 pH梯度的变化对抗癌药物的输送具有很重要的意义。pH 敏感的纳米给药系统在生理 pH 条件下稳定存在，当达到 pH 触发点后会迅速释放出药物。常用于 pH 敏感触发制剂的电荷翻转 pH 响应性基团主要有3种（图2）：酸不稳定的酰胺键（A）、苯甲酰亚胺键（B）和可电离的胺基（C、D）[14]。

Fig. 2 Three typical kinds of pH-responsive chemical structures图 2 三种常用的 pH 敏感基团

2.1.1 肿瘤微环境触发

肿瘤微环境被认为是 NPs 进入肿瘤组织的第一道屏障。研究发现，与中性的正常组织相比，肿瘤微环境表现出温和的酸性。因此，这种 pH 差可以作为电荷翻转的有效刺激因素。Zhou 等[15]将多种功能基团同时接枝于β-聚苹果酸（PMLA）骨架上，制备了一种抗体介导的具有 pH 敏感电荷翻转特性的多重功能纳米接枝物，以期实现肿瘤细胞对药物的高效摄取。当 pH 值由 7.4 降至 6.8 时，该纳米接枝物具有显著电荷翻转特性，Zeta 电位由 − 11.62 mV 变为 + 9.04 mV。这种改变可使抗体介导和载体响应肿瘤微环境电荷翻转形成的表面正电荷协同促进纳米接枝物的入胞，且载体表面正电荷促进入胞的作用优于抗体介导，两种方式同时修饰可以使纳米接枝物具有更好的抗肿瘤活性。Zhao 等[16]通过层层自组装制备了具有 pH 敏感和荧光肝靶向功能的空心微球。该纳米微球表面电荷可以在中性或碱性条件下由负电荷翻转成酸性条件的正电荷，表现出具有响应肿瘤微环境 pH 递送抗肿瘤药物的潜能。

2.1.2 肿瘤亚细胞水平触发

当 NPs 被肿瘤细胞内吞时，单一的 pH 响应型药物传递系统需要克服位于细胞器内的额外pH 相关的生物屏障，即内含体和溶酶体。其中，内含体和溶酶体的 pH 值为 4.5～5.5，明显低于细胞外微环境中的 pH 值，因此需要第二种机制在内切/溶酶体 pH 条件下迅速切割药物与聚合物之间的连接物以促进药物释放。Wang 等[17]构建了双 pH 敏感聚合物−阿霉素结合物（PPCHyd-DOX-DA），研究表明，在 pH 为 6.8 的条件下，氨基与二甲基马来酸酐（DMMA）之间形成的酰胺键是可以断裂的；不同 pH 条件下制剂的体外释放度试验结果显示，当 pH 值降至 5.0时，在 1 h 内释放出 75% 以上的阿霉素（DOX），表明 PPC-HYD-DOX-DA 对溶酶体 pH 敏感。由此可知，PPC-HYD-DOX-DA 可以通过化学机制响应肿瘤细胞外和细胞内的 pH 梯度，有望通过高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）同时促进药物在肿瘤部位的蓄积，促进细胞内化和细胞内药物释放，大大提高药物的传递效率。

综上，双 pH 响应型聚合物可在同一药物载体内显示，即在 pH 值为 6.8 的肿瘤微环境中和 pH 值 4.5～5.5 的内切/溶酶体隔间中，具有在两个 pH 条件下实现双重负电荷到正电荷翻转的优点。这样的策略不仅延长了循环时间，最大限度地减少了药物载体与血清成分的非特异性相互作用，而且还能促进抗癌药物的核递送。

2.2 还原反应触发电荷翻转

氧化还原是基于肿瘤细胞中高水平的 GSH 而发展起来的。正常细胞和肿瘤细胞之间的氧化还原电位梯度[18]可作为提高药物输送效率的有效刺激因素之一，因而这一特性可被用来设计具有还原响应特性的抗肿瘤药物递送系统，基于在血液循环中 NPs 结构完整稳定，当进入肿瘤组织内后，高水平的 GSH 导致载药系统的结构被破坏，进而加速药物的释放，提高药效。最常用的基于还原响应的结构是二硫键，其很可能是通过与谷胱甘肽的硫醇-二硫键发生交换反应或是在氧化还原酶存在下二硫键断开[19-20]。通常将一些疏水或毒性较强的药物通过二硫键与药物递送系统结合。Lin 等[21]使用壳聚糖衍生物通过二硫键修饰介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN），构建了载有 DOX 和 p53 基因的刺激响应纳米载体。首先，将二硫键连接在 MSNs 表面（MSNs-SSCOOH）上，并通过聚酰氨基胺（PAMAM）共轭壳聚糖合成壳聚糖的衍生物（CP）。然后，由MSN 和可生物裂解的 CP 制备氧化还原响应性纳米载体。通过电荷之间的静电相互作用将 NPs内化，之后通过质子海绵效应从溶酶体中逃逸，并释放 p53 基因。随后，在富含 GSH 的环境中放出 CP 外壳，然后将药物释放到细胞质中，进而更有效地诱导肿瘤细胞凋亡，其制备过程如图3所示[21]。

Fig. 3 Preparation of redox-responsive nanocarriers based on the chitosan derivative functionalized MSNs图 3 还原反应触发 MSNs 电荷翻转

2.3 酶触发电荷翻转

2.3.1 碱性磷酸酶

由于磷酸酶（如碱性磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶）可分解磷酸酯，近年来成为研究热点，可用于黏膜给药系统的设计。阳离子聚合物在黏液层发生正负电相互作用，导致聚合物给药系统渗透性差。Nazir 等[22]利用壳聚糖（CS）与硫酸软骨素（CHS）原位凝胶化形成聚合物纳米颗粒，用己糖激酶对 NPs 进行磷酸化（p-NP），通过将 NPs 与肠道碱性磷酸酶（AP）孵育来量化磷酸盐的释放，同时，监测了 Zeta 电位的变化，并考察了这些微粒的体外黏液渗透作用。结果发现p-NPs 的平均粒径为（412 ± 3.24 ）nm，Zeta 电位为 − 12.4 mV，当 p-NP 与 AP 孵育时，在4 h 内有大量的磷酸盐释放，Zeta 电位上升到 − 1.2 mV。与未改性纳米粒相比，p-NPs 表现出更好的黏液渗透性。由于 AP 的去磷酸化作用，使得细胞对 p−NPs 的摄取增加了近 2 倍，并且纳米颗粒没有表现出毒性，表明 p-NPs 的 Zeta 电位变化提高了黏液的渗透性和细胞摄取率。

2.3.2 基质金属蛋白酶

基质金属蛋白酶（MMPs）主要存在于肿瘤细胞外基质（ECM）中，与肿瘤的生长和转移密切相关，尤其是位于细胞膜外表面的 MMP-2 和在癌症许多阶段过度表达的 MMP-9 中[23-24]。肿瘤细胞可利用基质金属蛋白酶破坏在转移过程中所遇到的正常组织。MMPs 的表达和有效作用受多种因素的影响，而且多数 MMPs 是由肿瘤微环境中的基质细胞合成的，这也进一步说明肿瘤微环境为肿瘤细胞的转移提供了便利条件。同样 MMPs 的高表达成为区别肿瘤组织和正常组织的特征之一。

根据肿瘤部位谷胱甘肽的浓度较高与 MMP-2 过表达的特征，Zhu 等[25]设计了具有氧化还原、MMP-2 酶双敏感性的纳米颗粒，进行程序化紫杉醇（PTX）的释放。首先制备了含二硫键的紫杉醇前药 PTX-S-S-COOH，然后利用作为 MMP-2 底物之一的明胶制备了巯基化明胶（Gel-SH），最后得到巯基化修饰的两亲性聚合物 Gel-SS-PTX，将载药纳米粒在 MMP-2 环境下孵育，在 pH 值 5.5、6.5 的条件下考察载药纳米粒的变化，结果显示，随着时间的增加，NPs粒径逐渐减小且粒径分布也不均匀。这说明在肿瘤微环境（pH 6.5）和溶酶体（pH 5.5）的条件下，载药 NPs 可被 MMP-2 酶分解。

另一种在“刺激−响应”系统中常用的酶是透明质酸酶。Ran 等[26]构建了聚乙二醇（PEG）化透明质酸修饰的 siRNA 阳离子脂质体递送系统（PEG-HA-NP）。聚乙二醇与透明质酸（hyaluronic acid，HA）主链共价连接，然后将带负电荷的 PEG-HA 通过静电吸附包裹阳离子脂质体 siRNA复合物，形成 PEG-HA-NP，用于靶向肿瘤的 siRNA 递送，并证明了在肿瘤微环境中，该负电荷表面会被透明质酸酶剥离。

2.4 物理触发

研究显示，各种物理和化学刺激也可以引起 NP s的 Zeta 电位变化。例如光，它是能够快速和精确地释放抗癌药物的一种具有潜力的触发手段。自20世纪80年代以来，光动力疗法已经成为一种很有前途的治疗方法，它需要有光敏剂和适当的光源。以具有光响应性的电荷翻转 NPs 作为载体，将不同的药物输送到细胞中是目前 NPs 研究的热点之一，选择合适的光响应材料是达到最佳治疗效果的关键，光即是这些已经显示出潜力的物理刺激之一。Hu 等[27]开发了基于受保护的胺桥聚倍半硅氧烷的带光触发电荷翻转的功能纳米粒子，其表面带负电荷，在紫外光照射的触发下，这些纳米粒子表面电荷从 − 50 mV 翻转到 + 30 mV，这是因为粒子表面出现了胺亚基结构所致。Richling 等[28]设计了热响应电荷翻转系统，首先在磁性纳米粒子表面涂覆一层正电层的聚二烯丙基二甲基氯化铵，然后再包覆上一层阴离子层聚4−苯乙烯磺酸钠。进一步研究证明NPs 可在磁场中产生足够热量触发电荷翻转，从而导致层层解离。这种物理触发手段虽然常用于肿瘤治疗，但是它们不能给癌症治疗带来根本的改变，这是由于这种手段只能有效地治疗实体肿瘤，而对转移性肿瘤疗效较差。

3 电荷翻转纳米载体在药物递送系统中的应用

3.1 化药递送

许多抗癌药物，如阿霉素（DOX）、喜树碱和顺铂等都是通过使核 DNA 损伤或通过抑制参与 DNA 复制的拓扑异构酶来诱导细胞凋亡而发挥作用[29-30]，所以它们必须进入到细胞核内才能发挥疗效。但是，耐药细胞限制了药物进入细胞核，导致多药耐药性（MDR）有多种机制，主要有通过 P-gp 增加药物外排，激活 DNA 修复，改变药物代谢，药物靶标中的继发突变以及激活下游或平行信号转导途径等。此外，在某些耐药肿瘤细胞中，胞内的 pH 梯度会影响囊泡的转运作用，例如：阿霉素等药物仅在酸性细胞器中（如溶酶体）蓄积，而不会到达靶目标。所有抗 MDR的药物载体设计应该考虑能够促进药物在溶酶体等逃逸，否则会被迅速消除，从溶酶体内逃逸后应将药物迅速释放到细胞质中。此外，由于药物外排转运蛋白的过表达与肿瘤细胞中耐药相关蛋白的存在，电荷翻转载体应具有逃避并抑制相关蛋白活性的能力[31]。Jin 等[32]制备了基于两亲性脱氧胆酸修饰的羧甲基壳聚糖的自组装纳米颗粒，用于 DOX 的递送。pH 敏感的羧甲基壳聚糖自组装 NPs 的变形归因于羧甲基和胺基的质子化，壳层变得疏水，核变得疏松。载多柔比星自聚集纳米粒在耐药细胞中保留时间增加，从而相比游离 DOX 具有更好的抗肿瘤效果。Wang 等[33]通过二硫键将聚（ε-己内酯）和聚磷酸乙酯（PEEP）嵌段连接，自组装成氧化还原响应性胶束，实现了多柔比星在多药耐药肿瘤细胞中的更多积累和滞留，试验证明这种药物载体能迅速释放出DOX，以响应细胞内的还原环境。因此，该药物载体显著增强了 DOX 对多药耐药细胞的细胞毒作用。与直接孵育 MCF-7/ADR 细胞相比，带有 PEG 或聚磷酸乙酯壳层的纳米药物载体增加了多药耐药 MCF-7/ADR 细胞对 DOX 的内流，同时减少了 DOX 的外排，从而增加了 DOX 在细胞内的高滞留率。

3.2 基因递送

近年来由于基因治疗在传递缺失基因或缺陷基因方面的潜在作用，也广泛运用到肿瘤的治疗中。基因治疗中最重要的是有效基因治疗载体的设计（病毒载体和非病毒载体），这些载体可以将质粒 DNA、小干扰 RNA 或反义寡核苷酸（AON）运送到靶细胞中。与病毒载体相比，非病毒载体具有低毒、高载量、无免疫原性等优点，但其转染效率低，在血清中易失活等缺点也限制了其广泛应用[34]。为了克服以上缺点，可通过构建具有阳离子结构的两亲性材料来实现基因的高效传递。Li 等[35]设计合成了一种 PEG 修饰的 pH、还原双敏感的聚合物−组氨酸接枝硫辛酸壳聚糖（PHCSL），用 PHCSL 制备共载 siRNA 和依托泊苷的阳离子脂质体。经实验证明，该阳离子脂质体在不同 pH 和还原环境的粒径和电位变化具有环境响应性，并且细胞摄取结果表明该脂质体在弱酸性环境下摄取明显增强，并具有溶酶体逃逸的作用，从而可快速释放药物和递送基因至靶点进而发挥作用。Guo 等[36]构建了具有电荷翻转功能的聚烯丙胺柠康酸酐衍生物 (PAH-Cit)-PEI 金纳米粒复合载体，用于基因转染和传递 siRNA。PAGE 凝胶电泳结果证明了酸性环境下PAH-Cit 的电荷翻转能力。且当 Au/siRNA 质量比为 10︰1 时，此电荷翻转金纳米粒复合载体转染 siRNA 抑制 HeLa 细胞 Lamin A/C 基因的效率高达 80.0%。

3.3 蛋白递送

随着生物和基因工程技术的发展，也发现了许多功能性的肽和蛋白质。蛋白质的传统给药方式是口服和静脉注射给药，但是由于体积大，血浆半衰期短，易受酶清除，透膜效率低和口服生物利用度低等缺点，导致蛋白质等生物大分子在治疗中不方便给药。因此开发更有效的药物载体对蛋白给药至关重要。其中，电荷翻转策略具有提高稳定性，调节靶点的特异性，改善蛋白质在循环中稳定性等优点，可制备出功能更强的蛋白质载体[37]。

Coué 等[38]设计了主链上具有生物还原二硫键的聚酰胺（SS-PAAS）和侧链上具有 pH 响应性、带负电荷的柠檬酸基团，用于在中性 pH 条件下有效地递送和释放带正电荷的蛋白质，利用溶菌酶作为阳离子模型蛋白自组装成纳米复合物。在酸性条件下，如 pH 值为 5.0（内含体 pH）时，SS-PAAS 侧链上连接的酰胺键被分子内催化水解，使聚合物载体由负电荷翻转为正电荷，从而增加摄取，使蛋白质向胞浆输送增加，其过程见图4所示。Cai 等[11]构建了聚丙交酯−乙交酯共聚物（PLGA）和聚苯乙烯−4−苯乙烯磺酸盐（PSS）聚合物共混物组成的负电荷纳米载体，并通过静电吸附提高正电蛋白溶菌酶的载药量和释放性能。试验证明，PLGA 与 PSS 混合制得了带负电荷的 NPs，其蛋白载量随 PSS/PLGA 比值的增加而增加。pH 升高有利于吸附过程，可提高负载量。溶菌酶从 NPs 中的体外释放量依赖于载药量，且溶菌酶的活性保持不变。综上，此载体是具有高表面电荷密度的纳米颗粒，并可通过静电相互作用有效地吸附带正电荷的蛋白质。

Fig. 4 Self-assembly process of polymer charge reversal leads to polymer-protein mutual repulsion and release of lysozyme图 4 聚合物电荷翻转导致聚合物-蛋白质相互排斥释放溶菌酶的自组装过程

4 结论

总结了 NPs 的表面电荷与肿瘤的生理环境和 TME（即细胞内或细胞外微环境）之间的相互作用以及利用此特性设计出个性化的药物递送系统，研究证明，电荷翻转策略有利于提高治疗和诊断效果，为未来抗癌纳米药物的临床应用提供一种可行的解决方案。对外源或内源刺激敏感的智能纳米载体代表了一种新颖的靶向药物递送方式。特异性的刺激能够在所需的位置和时间触发药物释放，而且敏感响应型材料已经灵活地运用到不同的纳米药物递送系统中，其中电荷翻转给药系统运用了 pH、还原或特殊酶等条件进行设计。在细胞水平上，pH 敏感型可触发转运药物释放到晚期内含体或溶酶体中，或促进 NPs 从溶酶体逃逸到细胞质中。在组织/器官方面，人们还可以利用与肿瘤疾病相关的特定微环境变化以及病理情况，例如局部缺血、炎症性疾病或感染等，使 NPs 避免非特异性吸收进而增强药物向肿瘤的靶向传递。

尽管电荷可转化的高分子生物材料在治疗疾病方面取得了许多成就，但仍然存在许多挑战。需要更经济环保安全的电荷翻转聚合物，并且要提高载体的包封率和载药量，最重要的是，电荷翻转材料构建的制剂会存在药物泄露的情况，这不仅对健康组织有损害而且还会大大降低治疗效果，所以在克服阳离子困境这一问题上，应该花更多精力研究敏感型材料，制备出疗效更好的新剂型，使药物的临床转化成为现实。