基于流式细胞术的乳酸菌快速计数方法

□ 杨文奇 沈阳市食品药品检验所

在我国的食品检测标准体系中，乳酸菌是包含乳杆菌属、双歧杆菌属和嗜热链球菌属在内的几种不同属细菌的统称。其计数方法与细菌一致，如采用平板计数法、MPN法及免疫比色法等。但由于生化特征的差异，用于计数的培养基对不同菌群的选择性不同，现有方法均存在不同程度的不足。在流式细胞术出现后，研究人员通过不断探索，发现流式细胞术在细菌计数领域具有准确性较高，且检测速度快等优势，可以应用于食品微生物检测领域，并展示出其强大的技术优势。因此，在食品快速检测技术不断发展的今天，在食品安全检测时限要求不断提高的背景下，将流式细胞术应用到食品安全国家标准体系中的前景值得期待。

1 实验材料与方法

1.1 仪器与试剂

Attune NxT流式细胞仪（美国Thermo Fisher公司）；1378Ⅱ级A2型生物安全柜（美国Thermo Fisher公司）；Heratherm IMH400—S电热恒温培养箱（美国Thermo Fisher公司）；SX—700压力蒸汽灭菌器（日本Tomy公司）。

SYTO®24、碘化丙锭 PI、5—CFDA（美国Thermo Fisher公司）；磷酸盐缓冲溶液PBS（北京陆桥技术股份有限公司）。

1.2 实验方法

首先对预先接种保加利亚乳杆菌（LB）的过夜培养物进行倍比稀释处理，再应用染色剂对100 μL稀释菌液进行染色处理[1]。为获得染色效果良好的染色剂，使用不同的染色剂进行染色，具体如下：① 10 μL SYTO®24；② 10μL PI；③ 10 μL 5—CFDA； ④ SYTO®24 和 PI各 10 μL； ⑤ SYTO®24 和 5—CFDA 各10 μL；⑥ PI和 5—CFDA 各 10 μL。用灭菌的PBS缓冲液对染色后的菌液定容至1 mL后，在37 ℃的条件下孵育15 min，置于流式细胞仪中计数。另取100 μL的稀释菌液，按照平板计数法方法进行操作，通过对比分析，明确流式细胞术在乳酸菌计数方面的检测线性范围。

同时，在流式细胞术计数方法中，为最大限度提高计数准确性，本实验设定多个变量，根据流式图结果明确最优实验参数。设定的变量如下：①染色液浓度，SYTO®24设定为0.05、0.1、0.15 2 mmol/mL与0.2 mmol/mL 4个浓度梯度，PI设定为 5、10、15 μg/mL 与 20 μg/mL 4 个 浓 度 梯度；②孵育时间，设定为5、10、15 min；③上样速度与读取时间，上样速度设定为30、60、90、120 μL/min与150 μL/min，读取时间设定为30、60、90、120、150 s与 180 s；④仪器参数，调节流式细胞仪通道的增益和阈值参数，前侧向散射光通道与荧光通道的增益电压每次提升100，绿色荧光通道的阈值每次提升500。

2 实验结果与分析

根据上述对比实验，可明确最佳的流式细胞术乳酸菌计数方法的各项参数，为该方法的推广应用提供帮助。在方案①～③的单染方案下，获得的流式图不含核酸颗粒，说明不能区分乳酸菌的活性，计数准确性偏低；在双荧光染色方案中，方案④和⑥）表现出生物性颗粒，基于PI染料的不能透膜特征，可准确判断细菌活性，正确计数。且由于方案⑥的两种染料结合位点存在差异，因此，在流式细胞术乳酸菌计数中，可将SYTO®24和PI作为染料。

在不同染料浓度对比中，根据两种染料不同浓度的流式图对比，SYTO®24的浓度为0.1 mmol/L、PI的浓度为10 μg/mol时，计数效果最佳。

在不同孵育时间对比中，15 min下的流式图细菌颗粒表现最为显著，说明该时间下的计数较为准确。

在不同上样速度与读取时间对比中，中速与高速荧光信号更为稳定，以两者为基础进行正交实验，明确不同流速、时间对乳酸菌计数结果是否有影响，并对流速与时间进行单因素方差分析，上样速度为30 μL/min、读取时间为180 s时，均值最大，即计数效果最佳。

在不同仪器参数对比中，增益优化结果为：阳性区域起点置于1 000强度时，可全面检测乳酸菌；在荧光强度设定为1 000强度时，区分度最大；阈值优化结果如下：绿色荧光通道阳性区域为最优阈值，参数设定为1 000。

按照上述参数，应用流式细胞术对乳酸菌进行计数，并与平板计数法对比。对比结果显示，二者计数结果相差无几，相关性系数为0.995 5，说明该计数方法可在食品检测中推广应用。为明确该计数方法的检出限，按照上述方法，选择LB的过夜稀释液为检测对象，其余条件不变，将孵育时间缩短为3 min，获得的活菌数即为最低检出限，为3×108cells/mL。对于超过该数值的乳酸菌，需对其进行稀释处理，方可获得准确计数结果。

3 结论

综上所述，流式细胞术在乳酸菌计数中具有计数效率高、计数准确等优势，可推广应用。在应用流式细胞术进行乳酸菌快速计数时，可选择0.1 mmol/L的SYTO®24 和 10 μg/mol的PI作为染料，在37 ℃条件下对染色细菌液进行15 min的孵育，置于流式细胞仪中计数，流式细胞仪的最佳条件为流速30 μL/min、读取时间180 s、增益值与阈值设定为1 000。