时钟基因Period家族的昼夜节律在心血管疾病中的研究进展

张爱宁，张艺，季烨龙，熊永红，冷燕，夏中元

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

由于地球的自转及公转运动，生物环境在24 h的周期循环中不断变化。地球上的生命基于环境演化出适合日常生存的分子钟。生物体内的基因表达受24 h周期的调控，即生物体基因的表达具有节律性，大多数生物体普遍存在的一个昼夜节律行为即进食/禁食周期，它影响机体的新陈代谢[1]。在哺乳动物中，昼夜节律会影响各种生理行为(睡眠-觉醒周期、内分泌系统、体温、运动活动等)，其本质受机体内生物钟的驱动[2]。若昼夜节律被打乱，机体将会发生一系列病理生理的改变。有学者利用化学诱变的方法，在果蝇体内发现了一种可调节昼夜节律的基因，并将其命名为Period (Per)基因[3]。Per基因家族是调控昼夜节律生物钟的核心组分之一，哺乳动物有3个Per同源基因，即Per1、Per2和Per3，在调节体内昼夜节律变化中发挥关键作用。Per基因家族的3个成员在心血管系统不同成分中的表达略有差异，发挥的生理作用也有所不同，三者通过各自的作用机制协调合作，共同实现心血管系统昼夜节律的稳定。已有研究证实，Per基因及其昼夜节律与许多心血管疾病的发病机制有关，包括心肌梗死、心肌梗死后的缺血再灌注损伤和心力衰竭等[4]。现就时钟基因Per的昼夜节律与心血管疾病关系的研究进展予以综述。

1 Per基因与生物昼夜节律的基础研究

1.1Per基因的生物学特点与昼夜节律 昼夜节律最早被科学家们用来描述改变果蝇飞行行为节律的24 h内源振荡，而Per基因是第一个被发现的控制昼夜节律的遗传成分。1984年，有学者首次测出了Per基因附近的基因组DNA序列，这段DNA可转录出长度分别为0.9 kb和4.5 kb的两种信使RNA，且长度为4.5 kb的信使RNA在胞内的浓度波动符合昼夜变化规律，其对应的DNA序列即为Per基因[5]。

Per基因作为调控昼夜节律的关键基因，与其他时钟基因[Bmal1 (brain and muscle aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 1)、Clock (circadian locomotor output cycles kaput)和Cry (cryptochrome)等]共同形成可精确控制生物节律的一系列与转录/翻译相关的正负反馈环路，而Per基因是该振荡环路关键的负性调控元件。在生物节律的主要反馈回路中，两个转录因子Bmal1和Clock与Per基因启动子区的E-box元件相互作用，激活Per基因在细胞核内转录信使RNA，进入细胞质后则受正反馈调节，不断翻译产生目的蛋白，即Per1、Per2和Per3蛋白[6]。当Per蛋白在胞质中逐渐聚集达到一定浓度后，会与另一时钟基因Timeless的翻译产物Tim蛋白发生相互作用，使Per蛋白可被胞质中的酪蛋白激酶1ε磷酸化，随后穿梭至胞核，与含有E-box序列的转录启动子结合，发挥其负性调控作用，抑制Per基因的转录，从而调节和控制机体的昼夜节律[7]。

在通路的负反馈循环中，一个关键的特征为抑制复合物Per-Tim蛋白在夜间的缓慢积累，该抑制复合物在细胞质内的浓度逐渐升高，达到峰值后又开始降低，且升高与降低两个阶段在时间上同步于24 h周期中细胞核内转录的活跃和不活跃阶段[8]。这就要求细胞质中Per-Tim信使RNA根据时间节律维持和调节自身的稳定性。POP2(pyrin-only protein 2)是一种腺苷酸酶，是腺苷酸化复合体CCR4-NOT(carbon catabolite repression 4-negative on TATA-less)的一个亚基，可缩短信使RNA的多聚腺苷酸(A)尾的长度，当胞质中的POP2浓度降低时，Tim信使RNA的多聚腺苷酸化增强，使得多聚腺苷酸(A)尾长度增加，维持Tim信使RNA的稳定性；POP2并不控制Per信使RNA的稳定性，反之，Per基因通过某种间接机制抑制POP2依赖性的Tim信使RNA腺苷酸化[9]。

1.2Per基因在心血管系统中的表达 哺乳动物的昼夜节律系统由分层的多振荡器结构组成，主要包括中枢起搏器(中央时钟)和外周振荡器(外围时钟)，两者通过神经-体液网络相互连接。中央时钟位于下丘脑的视交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)，同步化整个人体的外围时钟，而外围时钟在受到中央时钟调控的同时，也可独立调节机体组织器官的节律活动[10]。已有学者通过实验发现，SCN损伤的小鼠外周器官中仍具有恒定水平的时钟基因表达[11]。Per基因家族在中央、心脏及血管外围时钟中均有表达，且Per1的表达具有高度的心肌特异性，它与心肌细胞内钙循环关键因子——钙转运ATP酶的昼夜节律等密切相关[1]。Per2可在心肌和血管内皮等细胞中表达，参与调节内皮依赖性血管舒张等，同时参与内源性心肌缺血的保护机制[2]。Per3在灵长类，包括在人类中的表达均具有串联重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)多态性，这种多态性会影响包括心脏在内的不同组织中各种基因的昼夜节律表达，有助于心脏功能的调节[12]。Per基因家族与其他时钟基因共同作用于心脏和血管，以维持血压、心率、心肌细胞电活动以及机械活动的昼夜节律性波动。

2 Per基因调节心血管系统的作用机制

与其他外周组织相比，心血管系统中核心时钟基因的表达更为丰富。由于Per1、Per2和Per3在心脏和血管中的表达水平不同，三者既通过各自不同的机制参与心血管系统的生理活动，同时又相互协调，与其他时钟基因共同维持心血管系统的昼夜节律。

时钟基因 Per1参与细胞钙循环的调节，但具体机制目前尚未明确。钙循环是指细胞内钙离子(Ca2+)不断地释放和再摄取，这一过程驱动心肌收缩和舒张。肌质网Ca2+-ATP酶(sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)是维持细胞内钙循环的关键因子，主要在兴奋-收缩偶联过程中负责Ca2+的再摄取[13]，SERCA2a是SERCA在心脏中表达的亚型。当细胞内Per1浓度达到昼夜高峰时，SERCA2a的活性达到昼夜最低值，心肌的收缩和舒张活动减弱；同时，Per1对肾脏钠的重吸收具有调节作用，间接调节机体血压的昼夜变化[14]。Richards等[15]的实验数据表明，Per1参与肾小管上皮细胞钠离子通道(epithelial sodium channel，ENaC)α亚基的基础调节以及醛固酮诱导的调节。ENaC是肾集合管钠重吸收的重要调节因子，负责钠重吸收的微调，进而有助于控制血容量，起到调节血压的作用，当Per1基因被敲除或表达受到抑制时，ENaC的活性显著降低，钠的重吸收减少，血压降低[16]。除ENaC外，Per1还协同调节了其他参与钠重吸收的多个基因的表达[17]。

时钟基因Per2是调节血压和心率昼夜节律变化的关键组成部分，参与维持血管正常的舒缩功能。Per2基因突变的小鼠表现出血压降低、心率加快的趋势[18]。研究证实，小鼠Per2基因突变可导致主动脉内皮功能障碍，包括一氧化氮生成减少、血管舒张性前列腺素减少以及由环加氧酶1衍生的血管收缩剂释放增加[19]，表明Per2可能在调节血管功能中发挥作用。此外，Per2基因还通过直接且特异性地抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ来调节白色脂肪组织中的正常脂质代谢，Per2基因突变会导致脂质分解显著减弱，动脉内脂质加速沉积[20]。同时，另一项研究证实，Per2基因具有调节缺氧诱导因子1α的作用，可促进心肌细胞进行高效糖酵解，作为腺苷受体亚型A2b的靶基因，Per2在A2b的调控下控制依赖于缺氧诱导因子1α的心脏代谢和局部缺血耐受[21]。因此，Per2似乎在心脏缺血适应的调节中起着不可或缺的作用，也可能参与血管功能和代谢的调节。

时钟基因Per3在心脏中的表达与心脏活动的昼夜节律同步，其基因表达水平与心脏的日常适应相关，若心肌细胞为适应持续的压力超负荷而发生肥大，Per3基因的表达也将受到影响[22]。另外，在血管平滑肌内也可找到Per3基因。研究人员已发现，体外培养的人颈动脉血管平滑肌细胞和在体人颈动脉血管平滑肌细胞均具有时钟基因Per3、Bmal1等的节律性振荡，它们对血管壁的结构和功能起重要作用，参与动脉粥样硬化和斑块破裂的发病机制[23]。另外，Per3基因可调节血管壁固有成分的含量，从而改变血管壁刚度，维持血管顺应性[24]。Per3 VNTR可影响睡眠稳态和个体间的睡眠偏好，而睡眠周期影响心脏的自主调节，特别是交感迷走神经的平衡，其机制之一为Per3基因通过对白细胞介素-6、B型脑钠肽和维生素A等物质的浓度调节，调整血压和心率的变化，参与心血管代谢活动[25]。

3 Per基因与心血管系统疾病

心血管系统的许多生理活动会在一天内随时间发生规律的波动，表现出惊人的昼夜时间依赖性震荡，以维持正常的生理功能。事实上，在心脏和血管中，约10%的基因转录和约10%的蛋白质翻译受到昼夜节律的调控[26]。昼夜节律紊乱可导致心脏病风险增加和不良心血管事件的发生，不利于疾病的转归。机体可由于血压、心率、心排血量、外周血管阻力、血管舒张激素活性或血小板反应性等方面的昼夜变化而引发不良心血管事件，其中心肌缺血、心肌梗死、心源性猝死或室性心律失常等常发生于清晨[27]。心肌梗死期间的疼痛发作具有昼夜变化规律，发病率在清晨增加，在晚上出现第二个小高峰[28]。Per基因作为昼夜节律振荡回路中的核心环节，以多种机制在心血管疾病的发生、发展过程中发挥作用。

3.1Per基因与高血压 原发性高血压是多种心血管疾病的独立危险因素。一天中，正常机体的血压会在一定范围内发生波动，通常在清晨6～8点达到高峰，而在夜间1～2点熟睡状态下降至全天最低值。昼夜节律的中断或紊乱会影响血压的正常调节，永久性夜班的工人在血压和心率升高的同时，心率变异性会有所降低，其收缩压和舒张压升高后，血压恢复的时间较正常情况有延迟[29]。Per基因在控制血压方面起着重要作用，但其作用机制目前尚未完全清楚，而原发性高血压又可影响Per基因的表达，改变其转录与翻译的节律。一项研究显示，与正常血压对照者相比，高血压患者肾脏髓质中Per1信使RNA的浓度显著增加[30]。Tanaka等[31]通过收集原发性高血压大鼠在12 h明暗周期下每隔4小时的肾上腺及血清样品，并从中提取信使RNA分析时钟基因的表达发现，Per2、Per3、Bmal1等时钟基因在肾上腺中的表达相位较对照大鼠均有所提前。与野生型小鼠相比，给予高盐饮食和长效醛固酮类似物去氧皮质酮戊酯Per1基因敲除的雄性小鼠在发生原发性高血压风险降低的同时，会出现显著的血压节律紊乱[32]，而雌性小鼠可免受血压调控失常，部分原因可能由于卵巢雌激素对心血管产生的保护作用[33]。以上研究均表明，Per基因具有调节血压、维持血压正常节律的作用，且Per基因的突变与原发性高血压有密切关系。

3.3Per基因与心力衰竭 由缺血性心脏病继发的心力衰竭是全球人口发病率和病死率的主要原因，而缺血性心脏病的发作具有显著的昼夜节律性。Montaigne等[43]的随机研究结果显示，在行主动脉瓣置换术的患者中，手术时间为下午组的围手术期主要不良心脏事件发生率低于清晨组，而午后患者的相对危险性降低是由围手术期心肌梗死和急性心力衰竭发生率降低所致。这意味着心力衰竭的发生具有时间节律依赖性。此外，已有实验证明，昼夜节律变化有助于缺血性心脏病和心力衰竭的心肌重构[33]。如正常24 h生理周期的C57BL/6小鼠，若改变其光暗轮换周期，所产生的压力超负荷诱导的心肌肥大较在正常24 h光暗周期下的小鼠更严重，证明中央时钟与外围时钟调控节律的不同步会加剧心脏重构，并可迅速进展为心力衰竭[44]。急性心肌梗死发生时，缺血区域时钟基因的振荡幅度衰减，且缺血与非缺血区域生物钟节律的不同步性，加剧心肌梗死的恶化和心力衰竭的发生[45]。这些研究提示，时钟基因表达异常可能是调控心肌缺血再灌注损伤的重要病理生理机制。心力衰竭的特征之一是SERCA2a表达水平和活性降低引起的肌质网Ca2+摄取受损，SERCA2a功能障碍所致的钙循环紊乱是心肌缺血再灌注损伤加重的关键[46]。研究发现，p38促分裂原活化的蛋白激酶磷酸化是经受磷蛋白途径活化SERCA2a的关键，而p38促分裂原活化的蛋白激酶具有昼夜节律性，且由 Per1直接调控[47]。这些证据表明，Per1基因参与了缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生、发展。盐皮质激素受体拮抗剂对全因性心力衰竭有显著的治疗作用，而盐皮质激素受体可介导心脏炎症和纤维化，心肌细胞盐皮质激素受体选择性缺失可导致心脏中的Per2基因失调；缺乏外周组织正常昼夜节律时钟振荡的小鼠对脱氧盐皮质激素的特征性心脏炎症/纤维化反应显著减弱；同时，H9c2心肌细胞时钟基因表达的增加增强了盐皮质激素受体介导的Per1基因的反式激活，提示转录因子在心脏炎症/纤维化和心力衰竭的发展过程起协同作用[48]。

3.4Per基因与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化的好发人群主要为老年人，几乎每个老年人均有不同程度的动脉硬化。近年来，随着人们生活质量的不断改善，动脉粥样硬化发病逐渐呈年轻化趋势，其病变的基础为脂质代谢障碍。研究人员将敲除Per1、Per2基因小鼠的主动脉移植到野生型小鼠体内，野生型小鼠发展为顽固性动脉硬化疾病，证明了时钟基因在动脉硬化性疾病实验模型中作为自主影响的重要性[49]。Per2基因突变的小鼠，由于一氧化氮生成减少及环加氧酶1衍生的血管收缩剂释放增加表现出主动脉内皮功能障碍，增加了促炎因子的表达，推动了动脉粥样硬化的发展[50-51]。另有研究显示，从动脉粥样硬化病变中分离出的血管平滑肌细胞中的Per2基因表达维持在相对恒定的水平，昼夜振荡受到破坏[52]。脉搏波速度的增加是动脉僵硬的一个指标，Asmar等[53]通过评估血流速度波形沿动脉段的传输时间，发现Per基因敲除的小鼠主动脉的脉搏波速度增加；进一步通过计算测得Per基因敲除小鼠的血管壁厚度及刚度增加，血管顺应性降低，说明Per基因在维持血管顺应性、阻遏动脉硬化方面具有正向作用。高胆固醇血症是发生动脉粥样硬化的危险因素之一，高胆固醇血症和昼夜节律异常的结合可能影响心血管疾病的进展。Akashi等[54]通过向Per2基因引入突变，产生了昼夜节律受损的低密度脂蛋白受体缺陷小鼠，而在小鼠发生高胆固醇血症的同时，其动脉斑块面积也显著增大，这意味着Per昼夜节律紊乱加速了动脉粥样硬化的进展。

4 小 结

昼夜节律紊乱可破坏心血管系统的正常生理功能。Per基因通过各种复杂的分子机制调节心血管系统的活动，参与多种心血管疾病的病理生理过程。对Per基因及其调节因子进行靶向治疗，为心血管疾病的治疗提供了新思路和研究方向。已有研究者发现，可通过强光治疗诱导Per2依赖性miR-21的表达上调，调节心肌细胞缺氧和代谢途径，从而发挥心脏保护作用，减小心肌梗死面积[55]。L-茶氨酸也被证实可增加Per2、Bmal1、Cry1等时钟基因表达的昼夜振荡幅度，在调节血管昼夜节律系统中起重要作用，从而预防代谢综合征和心血管疾病[56]。随着Per基因对心血管系统的影响机制不断被阐明，Per基因有望成为治疗心血管疾病的新靶点。