miR-340 对背根神经节神经元兴奋性和钠通道电流的作用*

马颂华，邢玲燕，苏文凤，陈 罡1，

（南通大学1 医学院；2 江苏省神经再生重点实验室，江苏226001）

神经病理性疼痛是常见的慢性顽固性疼痛综合征，患者占全球人口的7%～10%[1-2]。外伤、缺血、先天性疾病均可造成神经病理性疼痛的发生和发展，但其分子机制复杂，临床缺乏有效的治疗手段。micro RNAs（miRNAs）家族是一类长度18～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，于体内广泛存在，在生物发育、细胞增殖和凋亡等生理及病理过程中发挥重要的调控作用[3]。近年来，miRNAs 在神经病理性疼痛中的作用受到越来越多的关注，可能成为镇痛治疗的新方向[4-5]。脊髓背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）神经元是躯体初级感觉传入的第一级神经元，在感觉感知、调节和传导过程中起着极为重要的作用。调节DRG 神经元电压依赖性钠离子通道（voltagedependent sodium channels，VDSC）的表达及功能，可直接影响神经病理性疼痛的发生、发展及维持过程[6]。本研究主要观察miR-340 对DRG 神经元VDSC 的作用，以揭示其与神经病理性疼痛的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选取5～6 周龄ICR 小鼠，雌雄不拘［SPF级，许可证编号：SCXK（苏）2019-0001，由南通大学实验动物中心提供，饲养于恒温恒湿饲养笼中，12小时循环光照］。Neurobasal 培养基、胶原酶（type ⅠA）、胰蛋白酶、EGTA、HEPES、CsCl、Na2-ATP（Sigma 公司），miR-340-3p-mimic（吉玛基因公司），其余试剂均为国产分析纯。

1.2 小鼠DRG分离及神经元培养 ICR 小鼠以4%乙醚吸入麻醉，75%酒精消毒后迅速剪开背部皮肤，取出胸腰段脊柱。沿矢状面将脊柱从中线对剪，剥离脊髓，摘取神经节。在显微镜下修剪DRG 周围结缔组织，置于胶原酶A（1 mg/mL）37 ℃孵育30 min，再加入胰蛋白酶（0.25 mg/mL）37 ℃继续孵育12 min，然后用Neurobasal 培养基清洗2 次，以终止酶的消化。用Pasteur 管轻轻吹打神经节，获取单细胞悬液，接种于放有玻片的培养皿，24 h 后用于膜片钳实验。

1.3 DRG 神经元诱发动作电位记录 采用全细胞膜片钳电流钳模式。细胞外液组成：NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl21 mmol/L，CaCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-glucose 10 mmol/L，用NaOH调pH至7.3。电极内液组成：K-gluconate 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl22 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Na2-ATP 2 mmol/L，用KOH 调pH 至7.25。保持钳制电位-80 mV，电位设置为0，指令电压为0，给予100 pA、500 ms 的电流脉冲诱发动作电位。膜片钳实验数据采用pCLAMP 10.2 软件采集，采样频率10 kHz，滤波频率1 kHz，Clampfit 10.2进行数据处理。

1.4 DRG 神经元全细胞记录钠电流 采用全细胞膜片钳电压钳模式。细胞外液组成：NaCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-glucose 12 mmol/L，用NaOH 调pH 至7.3。电极内液组成：CsCl 140 mmol/L，KCl 5 mmol/L，MgCl22 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Na2-ATP 2 mmol/L，用CsOH 调pH 至7.25。电极阻抗3～5 MΩ。选择胞膜完整性好、折光性强、胞质均匀的直径＜40 μm 的中小型DRG 神经元进行封接。封接电阻＞1 GΩ，破膜后进行膜电容和串联电阻补偿（串联阻抗补偿80%），保持钳制电位-80 mV，给予50 ms、10 mV 的阶跃脉冲电压，从-70mV 去极化至+40 mV。先记录正常对照时的钠通道电流，然后灌流miR-340-3p（用标准细胞外液稀释至10 μmol/L，持续灌流细胞2 min），再次给予同样脉冲电压刺激，记录钠通道电流。

1.5 统计学处理 应用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析，计量数据以±s表示，组间差异性比较采用t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-340-3p 对DRG 神经元膜静息电位的影响 在给予miR-340-3p 前DRG 神经元的膜静息电位（resting potential，RP）为-49.50±4.76 mV，灌流miR-340-3p（10 μmol/L，2 min）后膜的静息电位为-52.13±5.32 mV，两者差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 miR-340-3p 对DRG 神经元膜静息电位的影响

2.2 miR-340-3p 对DRG 神经元诱发动作电位的影响 在诱发到动作电位的6个细胞中，在给予miR-340-3p 前诱发动作电位数为1.8±0.75个，灌流miR-340-3p（10 μmol/L，2 min）后诱发动作电位数为5.6±0.51个，两者差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 miR-340-3p 对DRG 神经元诱发动作电位的影响

2.3 miR-340-3p 对DRG 神经元钠通道电流的影响 如图3 所示，miR-340-3p 可以增加钠通道电流，电流-电压曲线表明在激活电压从-30 mV 至0 mV时，miR-340-3p 明显增加了钠通道电流密度，差异具有统计学意义（P＜0.05）。激活曲线也表明，miR-340-3p 使钠通道激活曲线左移，半激活电压从-22.6 mV 增加至-27.4 mV。

图3 miR-340-3p 对DRG 神经元钠通道电流的影响

3 讨 论

近年来的研究表明，miRNAs 与疼痛关系较为密切，如在脊神经损伤模型中，发现患侧DRG 神经元有63 种miRNAs 表达异常[7]；大鼠慢性坐骨神经压缩性损伤后7 d、14 d 与假手术组相比，有111 种miRNAs 发生明显变化[8]。miRNAs 不仅在神经病理性疼痛中表达异常，而且还扮演着重要的调控角色。文献报道，miRNAs 可通过其下游靶基因参与神经病理性疼痛的调节，如miR-30b 通过调节DRG 神经元NaV1.3 的表达水平削弱神经病理性疼痛的发生[5]，而miRNA-let-7b 也可直接作用于疼痛感觉传入神经元的瞬时感受器电位香草酸受体（transient receptor potential vanilloid，TRPV），调节DRG 神经元的功能活动，从而介导神经病理性疼痛的发生[9]。

miR-340 全长22 nt，能调控多种蛋白质的编码和翻译，从而调控细胞周期，影响肿瘤浸润转移等，被称为抑癌基因[10]。本课题组在研究坐骨神经损伤时曾观察到miR-340 可以调节轴突再生，并且出现表达先降低后升高的变化[11]。行为学结果提示坐骨神经夹伤后7天机械疼痛和热痛感觉并不灵敏，至损伤后14天左右时动物疼痛感觉逐渐加剧，至21天左右最敏感。提示miR-340 表达的升高可能与外周神经损伤引发的神经病理性疼痛有一定关系。

DRG 神经元是感觉传入初级神经元，在痛觉信号形成、信号传递以及信号调节中发挥重要作用。DRG 神经元胞体上分布多种离子通道和受体，周围局部环境的化学物质可以改变DRG 神经元的功能状态，如静息膜电位水平、兴奋性等，从而刺激神经元产生痛觉。本实验发现miR-340 尽管未影响DRG神经元的静息膜电位，但提高了DRG 神经元诱发放电的频率，并增加DRG 神经元电压依赖性钠离子通道（VDSC）的电流密度，提示miR-340 可能通过改变DRG 神经元兴奋性而介导传递痛觉信息。有证据表明，外周神经损伤后DRG 神经元上VDSC 的数量、分布及电生理特性发生改变，导致DRG 神经元的兴奋性增高、放电频率增加和产生异位放电，这些变化可能与神经病理性疼痛的形成密切相关[12]。