柠檬精油复合涂膜对椪柑采后品质的影响

张伟清 林 媚 王天玉 平新亮 冯先桔 王燕斌 姚周麟 徐程楠

(浙江省柑桔研究所，浙江 台州 318020)

柑橘(CitrusreticulataBlonco)是我国栽培和产量第一大水果，其果实糖度高且富含维生素C(vitamin C, Vc)。由于缺乏先进的采后保鲜技术，导致大量果实在贮运过程中易发生腐烂变质[1]，其中由青霉菌和绿霉菌引起的腐烂最严重[2]。目前生产上常使用抑霉唑、咪鲜胺、2-4D等化学杀菌剂来减少柑橘采后病害以延长贮藏期，然而化学杀菌剂易造成农药残留及环境污染问题[3]。因此，研制高效、安全、天然的新型柑橘保鲜剂具有非常重要的现实意义。

多糖类可食用膜材料，如壳聚糖，因其具有良好的成膜性、生物相容性和抑菌性而广泛应用于果蔬等食品保鲜[4-6]，能有效降低果实腐烂造成的损失[7-9]，但其存在抑菌范围窄、稳定性以及抗氧化性差等问题[10]，因此在实际应用过程中需添加抗氧化物或抑菌剂来改善上述问题[11]。研究发现植物精油对多种果蔬病原真菌有较强的抑制作用[12-13]，且抗氧化性好，可单独或复合可食用材料用于果蔬保鲜。张文勇等[14]研究表明，柑橘精油可有效减少草莓腐烂发生，并较好地保持果实的贮藏品质。范小静等[15]发现柠檬油微乳剂可有效延缓圣女果衰老，减少果实可溶性固形物(total soluble solid，TSS)、可滴定酸(titratable acid, TA)和Vc的降解。Mohamed等[16]研究表明柠檬精油等6种挥发性精油混合物可延长桃子4℃冷藏期至30 d。郑科旺等[17]报道柠檬精油-壳聚糖复合涂膜处理能显著减少鲜切山药Vc、水分等养分的流失。赵瑞鹏等[18]研究发现，柠檬精油微乳液能有效抑制鲜切苹果的菌落总数，减缓TSS含量的降低，其中500 μL·L-1浓度的柠檬精油微乳液保鲜效果较佳。曾祥燕等[19]报道壳聚糖中添加精油可抑制蜜橘的呼吸作用，减少果实腐烂率和失重率，并较好地保持果实营养价值。

椪柑成熟采收期非常短，易发生过熟现象，因而一般在果实未成熟时进行采摘，经贮藏成熟后再进行销售。然而目前有关精油壳聚糖复配保鲜椪柑的研究较少。因此，本试验以椪柑为试材，研究柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑果实贮藏过程中营养品质及生理变化的影响，以期为柠檬精油在柑橘采后的应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

椪柑样品于2016年12月采自浙江省柑桔研究所，当日运回实验室室温预贮存2 d；供试青霉菌(Penicilliumitalicum)和绿霉菌(Penicilliumdigitatum)由浙江省柑桔研究所植保实验室提供；柠檬精油，恒枫食品科技有限公司；琼脂、葡萄糖，美国Sigama公司；壳聚糖(脱乙酰度≥95%)、硫代巴比妥酸(分析纯)，上海麦克林生化科技有限公司；纳他霉素，浙江新银象生物工程有限公司；氯化钙(CaCl2,食品级)，浙江巨化股份有限公司；吐温-80、草酸，上海凌峰化学试剂有限公司；氢氧化钠、醋酸、三氯乙酸、氯化钡，国药集团化学试剂有限公司；超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

722s可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；WYA-2S阿贝折光仪、DDS-307电导率仪，上海精密科学仪器有限公司；KB240型微生物培养箱，德国Binder公司；85-2恒温加热磁力搅拌器，杭州仪表电机有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抑菌效果测定 参照胡秀荣等[20]的方法。将含50 mL培养基的三角瓶于微波炉中加热溶解，待其冷却至40℃左右时，分别量取0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和2.0%经1%吐温-80充分乳化的柠檬精油倒入三角瓶中，充分振荡摇匀后倒平板。将已制备的直径5 mm的青霉菌和绿霉菌菌丝块分别移入培养皿中，于25℃培养至第3和第7天时测定菌落直径。每个处理组3个重复，以不添加柠檬精油的培养基为对照组(CK)。

1.3.2 试验设计 试验设置5种不同涂膜液处理，分别为CK:对照(样品未经处理)；A:1.0%柠檬精油；B:1.0%壳聚糖的醋酸溶解液+1.0%CaCl2+300 mg·L-1纳他霉素；C: 1.0%柠檬精油+1.0%壳聚糖的醋酸溶解液+1.0%CaCl2；D：1.0%柠檬精油+1.0%壳聚糖的醋酸溶解液+1.0%CaCl2+300 mg·L-1纳他霉素。其中柠檬油经吐温乳化，壳聚糖醋酸溶解液的醋酸浓度为1%。

挑选大小均匀，果皮色泽以及果实成熟度相对一致、无损伤的椪柑，分别装入不同的涂膜液中浸泡2 min(10 L涂膜液浸200个果实)，捞出后自然晾干，然后置于垫报纸的塑料筐中，每个处理200个果实，重复 3次，常温贮藏，每隔15 d取1次样测定相关指标。

1.3.2.1 腐烂率和失重率测定 腐烂率：计数法；失重率：称重法。按照公式计算腐烂率和失重率：

腐烂率=贮藏后腐烂个数/总个数×100%

(1)

失重率=(初始重量-贮藏后重量)/初始重量×100%

(2)。

1.3.2.2 呼吸强度、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定 参照曹建康等[21]的方法，采用静置法测定呼吸强度，单位以mg·kg-1·h-1表示；采用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量，单位以μmol·g-1表示。

1.3.2.3 TA、TSS和Vc含量测定 参照GB/T 8210-2011[22]测定。

1.3.2.4 总糖含量测定 参照GB/T 5009.7-2008[23]测定。

1.3.2.5 细胞膜透性测定 参照贾晓辉等[24]的方法。采用电导率仪测定，以相对电导率表示。

1.3.2.6 抗氧化酶活性测定 采用试剂盒测定过氧化氢酶(catalase，CAT)、超氧化歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化物酶(peroxidase，POD)活性。

1.3.2.7 感官评价 参照曾祥燕等[19]的评分标准，略作修改(表1)，选6人对贮藏第90天的椪柑进行感官评价。

表1 椪柑感官评分标准Table 1 The sensory scoring standard of Ponkan

1.4 数据分析

采用Excel 97-2003进行数据整理分析，采用SAS 8.1软件差异显著性分析(P<0.05)，OriginPro 8.5软件制图。

2 结果与分析

2.1 柠檬精油抑菌效果

由表2可知，柠檬精油能有效抑制青霉菌丝体的生长，当柠檬精油添加量介于0.2%～1.0%之间时，抑菌效果随着柠檬精油添加量增加而提高，且不同添加量处理组间差异显著；当柠檬精油添加量增加至1.0%时，培养至第3天能100%抑制青霉菌活性。柠檬精油对青霉菌的抑制作用随着培养时间的延长明显下降，这与柠檬精油的抑菌持久性有关。低添加量柠檬精油对绿霉菌抑制作用较弱，当添加量为0.2%和0.4%时，可促进绿霉菌生长；当添加量达到0.6%时，柠檬精油对绿霉菌丝体的生长开始出现抑制作用；当柠檬精油添加量介于0.6%～2.0%之间时，其对绿霉菌的抑制作用随添加量的增加逐渐增强，且不同添加量处理组间差异显著。柠檬精油对绿霉菌的抑制作用也随着培养时间的延长出现下降趋势。由此说明，一定添加量的柠檬精油能有效抑制青霉菌和绿霉菌的生长。

表2 不同柠檬精油添加量对青、绿霉菌丝体生长的影响(n=3)Table 2 Effects of different adding amount of lemon essential oil on mycelium of Penicillium italicum and Penicillium digitatum (n=3)

试验中发现，当采用添加量大于1.5%的柠檬精油处理椪柑果实时，果皮会出现褐色伤疤，加速了果实腐烂进程，因而后续试验选择柠檬精油的添加量为1.0%。

2.2 柠檬精油及其复配处理对椪柑果实呼吸强度的影响

由图1可知，随着贮藏期的延长，各试验组椪柑果实的呼吸强度均呈先下降后上升的趋势。柠檬精油及复配处理均可抑制椪柑果实呼吸作用，整个贮藏过程中CK果实的呼吸强度明显高于其他处理组，且D处理组最低。贮藏第90天，CK椪柑果实的呼吸强度为18.72 mg·kg-1·h-1，与其相比，A、B、C和D组椪柑果实呼吸强度分别降低了7.8%、28.4%、21.1%和33.8%。综上表明，柠檬精油及其复配处理均能抑制椪柑果实的呼吸速率，而D处理组的抑制作用更强。

注：不同小写字母表示同一贮藏期不同处理组间差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant differencebetween various treatment groups at the same storage timeat 0.05 level. The same as following.图1 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑呼吸强度的影响Fig.1 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on respiration intensity of Ponkan

2.3 柠檬精油及其复配处理对椪柑果实腐烂率和失重率的影响

图2 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑腐烂率的影响Fig.2 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on decay rate of Ponkan

由图2可知，随着贮藏期延长，各试验组椪柑果实腐烂率均呈上升趋势，其中CK、B和C处理组果实在第15 天时出现腐烂，而A和D处理组在第30天时出现腐烂。整个贮藏期间，除A处理组椪柑果实腐烂率在贮藏第30和60天时与CK无显著差异外，其他处理组椪柑果实腐烂率均显著低于CK。贮藏第90 天时，CK椪柑果实的腐烂率高达23.0%，是D处理组的1.4倍。D处理组在贮藏第60～第90 天时椪柑果实腐烂率均显著低于其他试验组，表明，D处理组减少腐烂发生的效果较佳。

由图3可知，各试验组椪柑果实失重率在整个贮藏期间均有不同程度的上升。贮藏45～75 d后，处理组椪柑果实失重率显著低于CK。当贮藏至90 d时，A、C和D处理组椪柑果实失重率分别为23.76%、22.53%和20.16%，显著低于CK(25.52%)，CK与B处理组间无显著差异，且两组果实失重率均增加较快。可见，柠檬精油及其复配浸泡处理能有效降低椪柑储藏期间的失重率，其中D处理组的效果更好。

图3 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑失重率的影响Fig.3 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on weight loss rate of Ponkan

2.4 柠檬精油及其复配处理对椪柑果实感官评分的影响

由图4可知，椪柑果实经90 d贮藏后，A处理组果实外观、口感、结构和气味得分均与CK无显著差异。B处理组椪柑果实气味与CK间无显著差异，外观、结构和口感得分均显著高于CK。C处理组椪柑果实除结构评分外其他感官得分均显著高于CK。D处理组椪柑果实外观、结构、气味和口感得分分别为5.5、5.3、5.4和5.2，均高于其他试验组，表明D处理组能更有效地保持椪柑的感官品质。

2.5 柠檬精油及其复配处理对椪柑果实营养品质的影响

由表3、4可知，在整个贮藏过程中，各试验组椪柑果实的TSS和总糖含量总体呈先上升后下降再上升的趋势，这可能是由于贮藏前期果实内淀粉转化为可溶性糖引起含量上升，贮藏中期呼吸作用消耗糖原导致含量下降，贮藏后期失水导致TSS和总糖含量再次升高。除贮藏0、30、45和60 d外，A处理组果实TSS含量与CK间存在显著差异；第45天开始，CK椪柑果实TSS含量和C处理组之间均差异显著；B和D处理组在整个贮藏期间果实TSS含量始终显著高于CK。当贮藏至90 d时，A、B、C和D处理组椪柑果实TSS含量和总糖含量均显著高于CK，但A、B、C和D各处理组间均无显著差异。表明，柠檬精油及其复配处理均可较好地维持果实营养品质。

图5 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑TA含量的影响Fig.5 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on TA content of Ponkan

由图5可知，贮藏期间，CK和处理组椪柑果实TA含量持续下降，其中D处理组果实TA含量在贮藏30 d后显著高于其他处理组。贮藏90 d时，CK椪柑果实TA含量下降至0.17 g·100mL-1，下降最快，A、B、C和D处理组TA含量分别是CK的1.4、1.7、1.9和2.2倍。可见柠檬精油及其复配处理能减缓椪柑果实TA的降解，其中D处理组能更好地保持TA含量，维持果实风味品质。

表3 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑TSS含量的影响(n=3)Table 3 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on TSS content of Ponkan (n=3) /%

表4 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑总糖含量的影响(n=3)Table 4 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on total sugar content of Ponkan(n=3) /(g·100g-1)

由图6可知，各处理组椪柑果实Vc含量变化趋势一致，均随贮藏时间的延长而降低，其中D处理组果实Vc含量下降最为缓慢，在贮藏期间(90 d)损失了11.34 mg·100g-1，CK椪柑果实Vc含量损失了14.34 mg·100g-1，D处理组在贮藏第90 天时果实Vc含量是CK的1.2倍。从贮藏第15天开始处理组果实Vc含量显著高于CK，且第75天开始除CK外其他4个处理组间差异均达显著水平。综上表明，柠檬精油及其复配处理能有效延缓果实Vc的降解，其中D处理组维持Vc含量的效果更好。

图6 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑Vc含量的影响Fig.6 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on Vc content of Ponkan

2.6 柠檬精油及其复配处理对椪柑果皮细胞膜透性和果肉MDA醛含量的影响

机体维持正常代谢活动需要完整的细胞膜，通常用细胞膜透性来表示细胞膜的完整程度。由表5可知，贮藏过程中，各处理组椪柑果皮相对电导率均有不同程度的上升，其中D处理组变化最平缓，CK上升最快；贮藏至第90天时，D处理组和CK的果皮相对电导率分别上升至30.5%和38.9%，CK的果皮相对电导率是D处理组的1.3倍。从第60天开始，CK与其他处理组间差异均显著。 表明柠檬精油及其复配处理可有效保护细胞膜，减缓相对电导率的升高，其中D处理组效果最佳。

由表6可知，各处理组椪柑果肉MDA含量均随着贮藏时间的延长呈上升趋势，A、B、C和D处理组MDA含量始终低于CK，其中D处理组MDA含量增幅最小，CK升高最快。贮藏至90 d时，椪柑果实MDA含量高达1.860 μmol·g-1,显著高于B、C和D处理组，与A处理组之间无显著差异。表明柠檬精油及其复配处理可抑制椪柑果实的膜脂过氧化反应，其中D处理组的抑制作用相对更强。

表5 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对果皮相对电导率的影响(n=3)Table 5 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on relative electric conductivity of Ponkan(n=3) /%

表6 柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对果肉MDA含量的影响(n=3)Table 6 Effects of lemon essential oil and its mixture with chitosan, calcium chloride and natamycin on MDA content of Ponkan(n=3) /(μmol·g-1)

2.7 柠檬精油及其复配处理对椪柑果实抗氧化酶活性的影响

由图7-A可知，柠檬精油及其复配处理均能有效保持椪柑果实CAT活性。各处理组椪柑果实在贮藏期间CAT活性总体呈下降趋势，活性介于3.02～10.16 U·g-1之间。贮藏45 d内，各处理组在维持椪柑CAT活性方面的效果显著优于CK；贮藏45 d后，B、C和D处理组CAT活性显著高于CK，且D处理组CAT活性最高。贮藏90 d时，D处理组椪柑果实CAT活性降至6.10 U·g-1，是CK的2.0倍。由图7-B可知，各处理组椪柑果实SOD活性随着贮藏时间的延长呈先下降后上升的趋势，活性介于55.79～176.23 U·g-1之间。在整个贮藏期CK椪柑果实SOD活性显著低于其他处理组。贮藏90 d时，D处理组椪柑果实SOD活性显著高于其他处理组，说明D处理组清除自由基能力更强。由图7-C可知，柠檬精油及其复配处理均可减缓果实中POD活性的降低，各处理组在贮藏期间椪柑果实POD活性变化趋势一致，均先上升后下降。贮藏90 d时， A、B、C和D处理组果实POD活性显著高于CK，其中D处理组维持POD活性效果最优，其POD活性为89 U·g-1。

3 讨论

椪柑一般经贮藏完熟后销售，因此，维持果实品质和口感尤为重要。本研究结果表明，柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配均能不同程度地抑制椪柑果实呼吸作用，而且可以延缓果实TA和Vc含量的下降，减少果实失重和腐烂发生，更好地保持果实营养和外观品质。其中D处理组(1%柠檬精油+1.0%壳聚糖+1.0%氯化钙+300 mg·L-1纳他霉素的复合物)对椪柑的保鲜效果最好，这与曾祥燕等[19]利用柑橘精油、壳聚糖、氯化钙和溶菌酶复合液较好地保持雪峰蜜桔贮藏品质、减少果实腐烂的结果一致。此外，苟亚峰等[25]研究发现60 μL·L-1肉桂精油与1%壳聚糖和1%CaCl2复配处理砀山酥梨保鲜效果最优，这与本研究结论类似。这可能是由于壳聚糖在果蔬表面形成一层薄膜，通过调节果蔬内外气体交换，形成高CO2低O2的微环境，从而抑制呼吸作用对养分的消耗，减少水蒸气的渗透，达到保鲜果蔬的效果[26]；同时壳聚糖具有抑菌作用[26]；且柠檬精油作为天然抑菌物质，其含有的柠檬烯、萜烯、松油醇、柠檬醛等活性成分对青霉、绿霉和酸腐病菌具有较强的抑制作用[27-30]，与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复合使用，可对椪柑的保鲜达到协同增效的作用。

SOD、POD和CAT与果蔬贮藏品质的劣变紧密相关[31]，且3种抗氧化酶共同作用能减少自由基和H2O2对细胞膜的损伤，延缓膜脂过氧化产物——MDA的积累，从而达到延缓果实衰老的效果。魏彦珍等[32]研究发现，茶树精油能有效提高CAT 活性，保持草莓品质。钟曼茜等[33]表明黄皮精油熏蒸番木瓜果蒂能提高SOD活性，减少MDA积累，维持果实贮藏品质。宋姝婧等[34]发现，百里香精油能有效延缓樱桃番茄的衰老，保持果实品质和风味，减少MDA积累。杨莹等[35]表明选用浓度为6～8 μL·L-1的肉桂精油保鲜救心菜，可有效维持其CAT、SOD和POD活性，保持救心菜的贮藏品质。本研究也得到类似结果，柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配处理可以通过提高的椪柑果实CAT、SOD和POD活性来减少MDA积累，从而延缓果实衰老。这可能是由于柠檬精油能诱导椪柑果实通过调节抗氧化酶活性来降低机体所遭受的损伤，从而延缓衰老进程，减少腐烂发生。

本研究利用柠檬精油对椪柑进行采后保鲜，并分析了果实贮藏过程中营养品质与抗氧化酶活性的变化，发现柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素处理均可有效抑制果实腐烂率和失水率，保持营养和风味品质。但由于柠檬精油组分复杂，在椪柑保鲜过程中起重要作用的成分以及其保鲜机理尚不明确，有待进一步深入研究。

4 结论

本研究结果表明，柠檬精油及其与壳聚糖、氯化钙和纳他霉素复配对椪柑果实具有不同程度的保鲜效果。其中1%柠檬精油复合1.0%壳聚糖、1.0%氯化钙和300 mg·L-1纳他霉素处理椪柑果实保鲜效果最好，其果实Vc和TA含量最高，腐烂率和失重率最低，且在减缓果皮相对电导率升高和MDA积累，以及维持抗氧化酶(CAT、SOD和POD)活性方面的效果最优。