印度南瓜Na+/H+逆向转运蛋白基因CmaSOS1的克隆与表达分析

2020-12-02时丕彪洪立洲费月跃王伟义吕远大顾闽峰

核农学报 2020年12期

时丕彪洪立洲王军费月跃王伟义吕远大顾闽峰,*

(1盐城市新洋农业试验站，江苏盐城 224049； 2江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所，江苏南京 210014)

土壤盐渍化是限制农业可持续发展的重要因素之一，已成为严重的世界性环境问题[1-2]。目前，全球有8亿多公顷的土地受盐分的不利影响，严重危害了植物的生长发育[3-4]，其通过破坏细胞内离子稳态而导致细胞膜功能紊乱和代谢活动减弱，进而抑制细胞生长和诱导细胞死亡。盐渍土中主要的阳离子是Na+，因此在盐土环境中，植物必须将胞质Na+浓度降到最低才能承受盐胁迫[5]。在长期的进化过程中，植物形成了三种不同的机制来阻止和适应高浓度的Na+在细胞质中的积累：1) 活性Na+的外排；2) 液泡内Na+的区隔化；3) 限制Na+内流[6]。各种离子转运蛋白基因参与了以上生物学过程，其中Na+/H+逆向转运蛋白基因是较为重要的一类基因，在维持植物离子稳态中起着重要作用。目前，主要包括两类Na+/H+逆向转运蛋白，即Na+/H+逆向转运蛋白(salt overly sensitive 1,SOS1)和NHX1(Na+/H+逆向转运蛋白1)[7]，它们能将胞质中的离子保持在适当浓度，从而使细胞毒性最小化。NHX1位于液泡膜，通过把细胞内的Na+泵入液泡而降低细胞内Na+浓度[8-9]；SOS1位于质膜，能将细胞质内的Na+外排出细胞，也对Na+从根系到地上部的长距离运输十分有利[10]。

目前在很多植物中都发现了SOS1基因，其中，拟南芥AtSOS1基因首次报道[11-12]。当AtSOS1基因被敲除或突变失活时，拟南芥表现出对盐胁迫极为敏感的表型[13-14]。该基因编码的AtSOS1蛋白异常巨大，比拟南芥基因组中包含的其他阳离子/质子逆向转运蛋白都要大，这是因为其C端区域占整个编码区域的60%以上[15]。SOS1蛋白参与纯化的质膜囊泡中Na+/H+的交换活动，说明SOS1对植物细胞Na+和K+的平衡具有重要作用[16]。相关研究表明，过表达SOS1可提高转基因拟南芥和烟草的耐盐性[17-19]；盐胁迫能增加小麦TaSOS1的转录丰度[20]，诱导水稻OsSOS1基因mRNA的积累[21]，并引起拟南芥AtSOS1转录水平的上调[14]；不同植物SOS1基因的异源表达会抑制酵母突变体AXT3K的Na+敏感性，如拟南芥[22]、海神草[23]、番茄[24]等。此外，Ma等[25]对旱生植物霸王的研究表明，SOS1还控制着Na+和K+的长距离运输和空间分布，维持着霸王体内Na+和K+的稳态。但关于印度南瓜(CucurbitamaximaL.)SOS1基因的研究尚鲜见报道。

印度南瓜起源于南美洲，为葫芦科南瓜属一年生草本植物，富含类胡萝卜素、糖分、矿物质和维生素等营养物质，是南瓜属最重要的经济作物之一[26-27]。印度南瓜根系发达、抗逆性强，常被用作黄瓜、西瓜和甜瓜等的砧木，以增强其对土传病害和非生物胁迫的耐受性[28]。然而，目前对印度南瓜耐盐机制认识还比较薄弱，故挖掘耐盐基因和了解相关耐盐机制对培育耐盐印度南瓜品种具有重要意义。本研究通过对印度南瓜转录组测序数据进行分析，克隆获得印度南瓜SOS1基因cDNA全长序列，基于生物信息学方法初步分析该基因及其编码蛋白的结构特征，并利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR， RT-qPCR)技术分析CmaSOS1基因在盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，以期为进一步揭示CmaSOS1在非生物胁迫下的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和处理

印度南瓜材料由浙江大学蔬菜所提供。将印度南瓜种子杀菌消毒后于发芽盒进行催芽，待胚根突破种皮2～3 cm时进行水培处理。三叶一心期挑选长势一致的幼苗，并分别用200 mmol·L-1NaCl溶液和20%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG 6000)溶液进行盐胁迫和干旱胁迫处理，分别处理0、2、4、6、12、24 h后取根部组织，液氮速冻后保存于-80℃冰箱用以RNA提取。每个处理设3次生物学重复，以处理0 h的样品为对照。

1.2 印度南瓜总RNA提取及cDNA合成

用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取各组织及材料样品总RNA。基因克隆和表达分析所用cDNA模板分别按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒(美国Thermo Scientific公司)和PrimeScriptTMRT-PCRKit反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)说明书合成。

1.3 CmaSOS1基因的克隆

对印度南瓜转录组测序数据进行分析，根据UniGene功能注释结果获得一条CmaSOS1全长序列，并设计基因特异性引物，正向引物F：5′-TTAATCAAATCTATAATAAATGTCCTTATTCG-3′，反向引物R：5′-GACATTTAGAATAAACTTTTGGAATACGAC-3′，以印度南瓜叶片cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系总体积50μL，包含10×LATaqPCRbuffer5μL、dNTPmix8μL、cDNA模板2μL、正反向引物各1μL、LATaq酶0.5μL以及ddH2O32.5μL。PCR反应程序：94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火30s，65℃延伸3min20s，共30个循环；65℃延伸10min。PCR产物经胶回收纯化后，连接到pMD18-T载体上，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。菌液PCR验证为阳性单菌落的菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.4 CmaSOS1基因序列的生物信息学分析

利用ORFfinder分析CmaSOS1基因的开放阅读框架并翻译成氨基酸；在ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)上预测CmaSOS1蛋白的分子质量和理论等电点；利用NCBI上的CDD分析CmaSOS1蛋白的保守结构域；分别在GORIV(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)上预测蛋白的二级结构和三级结构；CmaSOS1蛋白的亲疏水性分析采用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在线软件；利用TMHMMServerv.2.0和SignalP-5.0分别进行跨膜结构和信号肽分析；亚细胞定位预测采用PSORT软件。利用ClustalX2.0软件对CmaSOS1及NCBI上下载的其他物种同源SOS1蛋白的氨基酸序列进行多重比对；使用MEGA5.05软件，采用邻接法(bootstrap=1000)构建系统进化树。

1.5 CmaSOS1基因的实时荧光定量PCR表达分析

根据CmaSOS1基因的序列设计定量PCR引物进行表达分析，CmaSOS1-Fq：5′-CTGCTGAGATGAACAAAAGGTC-3′和CmaSOS1-Rq：5′-TGTGCAGTAGTACTTGGTGGTCTC-3′；内参基因CmaEF1a[29]的引物为CmaEF1a-F：5′-CTGCGAGGCACCAGAGTTCC-3′和CmaEF1a-R：5′-CCCAATCGATGGTGTGTGCCA-3′。PCR反应体系为20μL，包含10μLSYBRgreensupermix(Roche)、5.5μLddH2O、正反向引物各1μL和2.5μLcDNA。反应条件：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

2 结果与分析

2.1 CmaSOS1基因全长cDNA序列的获得

以印度南瓜叶片cDNA为模板，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电泳获得单一条带(图1)，测序后获得印度南瓜Na+/H+逆向转运蛋白基因全长cDNA序列，命名为CmaSOS1，GenBank登录号为NW_019272028。该基因cDNA片段全长3 940 bp，包含一个3 429 bp的开放阅读框架，编码1 142 个氨基酸；5′非翻译区(untranslated regions，UTR)长161 bp，3′-UTR长350 bp(图2)。

注：M：DNA marker 5 000 bp；1：RT-PCR产物。Note：M：DNA marker 5 000 bp. 1：RT-PCR product.图1 CmaSOS1基因的RT-PCR扩增Fig.1 RT-PCR amplification of CmaSOS1 gene

2.2 CmaSOS1基因的生物信息学分析

2.2.1CmaSOS1基因的结构以CmaSOS1的cDNA序列为检索对象，在NCBI BLAST上进行比对，得到与之相对应的DNA序列。将CmaSOS1基因的cDNA序列与DNA序列进行比对后发现，在基因组水平上，CmaSOS1基因长度较大，全长46 314 bp，含有23个外显子、22个内含子、5′-UTR和3′-UTR(图3)。

2.2.2 CmaSOS1蛋白的理化性质利用ExPASy ProtParam分析CmaSOS1蛋白的理化性质，结果表明其分子式为C5714H9000N1510O1656S42，原子总数17 922，分子量为126.7 kDa，含有1 142个氨基酸。CmaSOS1蛋白的理论等电点为5.92，含有带负电荷残基(Asp + Glu) 120个，带正电荷残基(Arg + Lys) 101个，脂肪系数为101.50，蛋白质三维结构不稳定系数(Ⅱ)为39.08，小于40，表现为稳定状态。综上，推测CmaSOS1为酸性稳定蛋白。

2.2.3 CmaSOS1蛋白的二级结构和三级结构预测二级结构预测结果如图4-A所示，该蛋白主要有α-螺旋、无规卷曲和延伸链，无β-折叠。其中，无规卷曲所占比例最高为44.92%，其次是α-螺旋占39.23%，延伸链所占比例最少为15.85%。

利用SWISS-MODEL在线分析CmaSOS1蛋白的三级结构，结果表明，该蛋白的空间结构以α-螺旋和无规卷曲为主，含有少量延伸链，与二级结构预测结果基本一致(图4-B)。

2.2.4 CmaSOS1蛋白的亲水性/疏水性分析根据ProtScale工具预测，CmaSOS1的N末端有一个很强的疏水性结构，在第61位具有最高分值，为3.356，疏水性最强；而C末端有一个很强的亲水性结构，在第1 016 位具有最低分值，为-3.133，亲水性最强。该蛋白的亲水系数为0.079，该数值大于零，推测CmaSOS1为疏水蛋白。

2.2.5 CmaSOS1蛋白跨膜结构分析跨膜结构预测结果表明，CmaSOS1属于典型的跨膜蛋白，具有12个跨膜结构域，这与已报道的其他植物[1,14]Na+/H+逆向转运蛋白的跨膜结构域数目(10～12)一致。同时，用SignalP-5.0预测CmaSOS1信号肽的可能性值为0.000 3，小于0.5，因此该蛋白不存在信号肽，属于非分泌蛋白。

2.2.6 CmaSOS1的亚细胞定位预测根据PSORT预测，CmaSOS1最可能被定位于质膜(80.0%)，其次是叶绿体类囊体膜(50.8%)和高尔基体(40.0%)，再次是内质网(30.0%)。

图2 CmaSOS1基因cDNA序列及其推测的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence of CmaSOS1 gene and its deduced amino acid sequence

图3 CmaSOS1基因的结构Fig.3 Gene structure of CmaSOS1

图4 CmaSOS1蛋白的二级结构(A)和三级结构(B)预测Fig.4 Predicted secondary structure (A) and tertiary structure (B) of CmaSOS1 protein

2.2.7 CmaSOS1蛋白的保守结构域预测保守结构域预测结果如图5所示，CmaSOS1蛋白含有NhaP (Na+/H+or K+/H+antiporter) domain、Na_H_Exchanger superfamily和CAP_ED (catabolite gene activator protein-effector domain) superfamily等保守性区域，还含有一个配体结合位点(ligand binding site)和一个灵活的铰链区域(flexible hinge region)。

图5 CmaSOS1蛋白的保守结构域Fig.5 Conserved domains of CmaSOS1 protein

2.2.8 CmaSOS1蛋白的同源性与系统进化关系分析从NCBI数据库通过BLASTP下载中国南瓜CmoSOS1 (Cucurbitamoschata，XP_022955949.1)、西葫芦CpeSOS1 (Cucurbitapepo，XP_023525783.1)、甜瓜CmeSOS1 (Cucumismelo，XP_008466844.1)、黄瓜CsaSOS1 (Cucumissativus，KGN49745.1)、苦瓜McSOS1 (Momordicacharantia，XP_022146360.1)、月季RcSOS1 (Rosachinensis，XP_024192426.1)、毛果杨PtSOS1 (Populustrichocarpa，XP_024466547.1)、葡萄VvSOS1 (Vitisvinifera，CBI26761.3)、荷花NnSOS1 (Nelumbonucifera，XP_010276296.1)、枣ZjSOS1 (Ziziphusjujuba，XP_015894007.1)、海滨锦葵KpSOS1 (Kosteletzkyapentacarpos，AIS92905.1)和陆地棉GhSOS1 (Gossypiumhirsutum，NP_001313957.1)的氨基酸序列进行同源性比对，结果显示，上述物种与印度南瓜CmaSOS1氨基酸序列一致性分别为98%、98%、90%、89%、89%、74%、75%、75%、72%、71%、70%和70%(图6)，均表现出较高的同源性。

由图7可知，同属葫芦科植物的印度南瓜、中国南瓜、西葫芦、甜瓜、黄瓜和苦瓜的SOS1蛋白处于同一分支，具有较高的同源性，其中，中国南瓜CmoSOS1和西葫芦CpeSOS1与印度南瓜CmaSOS1的同源性最高，亲缘关系最近。印度南瓜CmaSOS1与锦葵科的海滨锦葵KpSOS1和陆地棉GhSOS1的亲缘关系较远。

图6 印度南瓜CmaSOS1与其他植物SOS1蛋白的氨基酸序列比对Fig.6 Amino acid sequence alignment of SOS1 proteins from Cucurbita maxima and other species

2.3 CmaSOS1基因的表达分析

2.3.1CmaSOS1在印度南瓜各组织中的表达由图8可知，CmaSOS1基因在印度南瓜各组织中均有表达，但具有明显的组织表达特异性。其中，CmaSOS1基因在根和叶中的表达量相对较高，其次是花和果实，在茎中的相对表达量最低，约为根中相对表达量的0.18倍。

2.3.2CmaSOS1在非生物胁迫下的表达分析CmaSOS1在不同的胁迫处理下具有不同的表达模式。由图9-A可知，在200 mmol·L-1NaCl胁迫下，该基因被诱导上调表达，在处理2 h达到最高峰，约为对照的1.2倍，在处理4 h时下降至对照的0.65倍，在处理6 h和12 h时基本保持稳定，在处理24 h时其相对表达量最低，约为对照的0.15倍。在20% PEG 6000胁迫下，CmaSOS1基因同样被诱导上调表达，在处理2 h时相对表达量达到最大值，约为对照的1.4倍，之后大幅下降，在处理6 h时达到最低值，约为对照的0.13倍，之后CmaSOS1相对表达量持续上升并在处理24 h时达到高峰，约为对照的1.3倍(图9-B)。

3 讨论

SOS1基因是植物耐盐性的关键基因，它所编码的Na+/H+逆向转运蛋白SOS1在调控Na+运输和维持细胞内稳态方面发挥着重要作用。研究表明，AtSOS1基因的过量表达能显著增加拟南芥植株的耐盐性[17]，而拟南芥AtSOS1缺失突变体大大提高了其对盐胁迫的敏感性[11, 30]。为研究SOS1基因对耐盐性的作用，已在地肤[1]、拟南芥[14]和盐角草[31]等植物中克隆了该基因并对其作用机制进行了探讨。本研究首次克隆获得一条印度南瓜CmaSOS1基因，其编码蛋白为疏水蛋白，在N末端具有一个很强的疏水性结构，C末端有一个很强的亲水性结构，这与菊花[2]SOS1蛋白结构相似，且在拟南芥中此亲水性结构参与对Na+信号的感知[14]，因此推测CmaSOS1蛋白C末端亲水性结构可能对印度南瓜细胞内Na+浓度具有一定的调控作用。Tang等[32]发现白杨SOS1蛋白定位于液泡膜，在液泡膜上发挥Na+区隔化功能。而本研究结果显示，印度南瓜CmaSOS1定位于质膜上，可能在调控Na+外排过程中发挥重要作用。印度南瓜CmaSOS1蛋白与中国南瓜、西葫芦、甜瓜、黄瓜和苦瓜SOS1蛋白的同源性较高，分别为98%、98%、90%、89%和89%，说明亲缘关系越近的物种，其SOS1蛋白同源性越高。

SOS1基因在植物响应非生物胁迫过程中发挥着重要作用。大量研究表明，水稻[21]、盐角草[31]、黄花草木樨[33]、胡杨[34]、海草[35]和苔藓[36]等植物在响应盐胁迫时其SOS1基因的表达量均显著升高。Xu等[20]发现小麦TaSOS1受盐胁迫诱导呈上调表达，而PEG 6000处理下无明显变化；而甘蔗ScSOS1受NaCl和PEG诱导后均呈上调表达[37]。Shi等[14]研究发现拟南芥AtSOS1的转录水平受盐胁迫诱导而升高，但不受干旱胁迫、低温胁迫和脱落酸(abscisic acid，ABA)处理的影响；而Song等[38]对大岛野路菊的研究表明，其SOS1基因表达量不仅受盐胁迫诱导而显著增加，还受干旱、低温和ABA处理的影响发生不同程度的变化。上述研究结果说明，不同物种SOS1基因在响应同一非生物胁迫时可能发挥着不同的功能。本研究结果表明，CmaSOS1基因具有明显的组织表达特异性，在印度南瓜根中的表达量最高，其次是叶片，在其他组织中相对表达量相对较低。该研究结果与前人在拟南芥[14]、盐角草[31]和星星草[39]中的研究结果一致。本研究还发现，高浓度NaCl和PEG 6000胁迫下，CmaSOS1基因均受到诱导而呈上调表达，且都在胁迫处理2 h时达到最高峰。由此推测，CmaSOS1基因可能在印度南瓜抵御盐分胁迫和干旱胁迫过程中发挥着重要作用，但关于其功能验证及调控机理仍需要进一步深入研究。

图7 不同物种SOS1蛋白的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree of SOS1 proteins from different species

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters mean significant differences at 0.05 level. The same as following.图8 CmaSOS1基因在印度南瓜不同组织中的表达Fig.8 Expression level of CmaSOS1 in different tissues of Cucurbita maxima

4 结论

本研究结果表明，印度南瓜CmaSOS1基因cDNA全长3 940 bp，包含一个3 429 bp的开放阅读框架，编码1 142个氨基酸。预测其编码蛋白CmaSOS1为酸性稳定疏水性非分泌蛋白，属于质膜型Na+/H+逆向转运蛋白家族，且SOS1蛋白在葫芦科植物中具有高度同源性。同时，CmaSOS1基因具有明显的组织表达特异性，在根中相对表达量最高，还可能在印度南瓜抵御盐分胁迫和干旱胁迫过程中发挥重要作用。后期的研究仍需利用转基因技术或RNA干扰技术对其功能做进一步验证。