高速逆流色谱法分离广陈皮中多甲氧基黄酮类物质的研究

何伟强 刘慈斌 何伟源

（1 广东鼎铭药业有限公司 广东 汕头 515000）

（2 汕头市中心医院 广东 汕头 515000）

陈皮又称为橘柚，是芸香科植物橘的干燥果皮，主要成分为黄酮和挥发油。2010 年药典认为橙皮苷是陈皮的重要成分，近年来发现川陈皮素和橘皮素是陈皮含量较高的多甲基黄酮类物质（PMFs）[1]。广陈皮是茶枝柑的干燥果皮，主要产自于广东省新会地区，具有较高的食用和药用价值，是广东三宝之首、广东十大中药材之一[2]。广陈皮具有清除自由基、抗氧化、祛痰、促进肠道平滑肌运动、促进消化等作用，临床上用于治疗功能性消化不良等疾病[3]。PMFs 是甲氧基≥4 的黄酮类化合物。PMFs 抗氧化、抗炎症反应、抗肿瘤活性、抗动脉粥样硬化[4]。本研究采用高速逆流色谱法（HSCCC）从广陈皮中分离多甲基黄酮类物质（PMFs）。

1.材料和方法

1.1 仪器和材料

高速逆流色谱仪（TBE-300），高效液相色谱系统（Agilent-1200），质谱仪，超导核磁共振仪，纯净水，分析纯试剂和无水乙醇。广陈皮，经过鉴定为茶枝柑的成熟果皮。

1.2 实验方法

（1）PMFs 的提取和富集：广陈皮干燥后过目筛得出粉末1000g，粉末加入2000ml 的烧瓶中，加入1000ml 95%的乙醇，加热回流1h，重复3 次后合并3 次提取液得到醇提出物。加入适量水悬浮装入树脂层析柱，静止1h，采用水、75%甲醇和95%甲醇洗脱接收洗脱物，浓缩后得到棕黄色粉末，放入冰箱内保存。

（2）容积体系和样本溶液的选择：HSCCC 的溶剂为正乙烷：乙酸乙酯、甲醇：水（4:6:4:6）加入漏斗中，充分混匀后静止得到固定相和流动相，超声洗脱30min 备用。

（3）固定相和流动相的选择：下相为固定相，上相为流动相时分离基线不稳定，固定相丢失，因此上相为固定相，下相为流动相。

（4）流动相体积流量、柱温和转速的选择：流动相过低导致分离周期延长，过高导致分离效果较差。柱温过低导致固定相丢失，柱温过高导致出现气泡影响分离。转速越快固定相保留率越高。因此流动相体积流量、柱温和转速分别为2L/min、860r/min35℃。

（5）HSCCC分离制备：固定相20ml/min的速度加入分离管中，充满管路，转速860r/min，液体相2L/min 注入，柱温35℃，按照色谱峰接受目标的馏分。得到A、B、C、D、E 5 个成分。

2.结果分析

2.1 HSCCC 溶剂的选择

合适的溶剂系统是HSCCC 的关键步骤，根据分离物的极性和参考文献，本研究选择正乙烷：乙酸乙酯、甲醇：水、氯仿：甲醇：水、乙酸乙酯：乙醇、水、氯仿：甲醇、正丁醇、水不同的溶剂系统进行分析，样本的分离系数k需要在一个合适的范围，如果k≤0.5出峰时间太快，分离变差；如果k≥1出峰时间太长，峰形变宽，本研究选择正乙烷：乙酸乙酯、甲醇：水上机试验，可分离出5 种PMFs 单体，图谱的峰形较好。

2.2 HSCCC 检测分析

对5 个成分进行检测，面积归化法测定A、B、C、D、E 的纯度分别为99.5%、98.7%、99.0%、86.3%、83.2%。D、E 纯度不足，需要进一步纯化处理。

2.3 化合物鉴定

化合物A 无色针状结晶（甲醇），分子式为C21H22O8，光谱数据与文献报道一致，故化合物A 为5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黄酮（川陈皮素）[5]。化合物B 黄色针状结晶（乙酸乙酯），分子式为C22H24O9，光谱数据与文献报道一致，故化合物B 为3,5,6,7,8,3’,4’—七甲氧基黄酮。化合物无色针状结晶（甲醇），分子式为C20H20O7，光谱数据与文献报道一致，故化合物C 为5,6,7,8,4’-五甲氧基黄酮（橘皮素）。

3.讨论

HSCCC 起源于20 世纪80 年代新型液液分离系统，固定相和液体相均为液体，利用溶质在互不相溶的溶液中分散系数不同进行分离，由于不需要固体介质避免固体填塞造成样本丢失，全部回收样品，分离量大，快速高效。分离柱容积大，无填料，柱内空间均为有效空间，制备量从毫克到克量级；溶剂用量少，成本低；适用于分离纯化。

应用HSCCC 分离天然产物需要选择良好的容积，控制上下两层在30s 内乳化，k值尽量控制在0.5 ～1 确定最佳的熔剂系统，此外选择合适的流动相体积流量、柱温和转速亦十分重要。

综上所述，采用HSCCC 分离得到纯度高的化合物，简便可行，不仅可以作为广陈皮质量控制的参考物质，而且为柑橘类植物分类提供科学的依据。